Gli-1與EMT相關(guān)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義*

李霞 徐美林 耿華 王菁 楊霞

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的首要原因，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的85%，多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差［1-2］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，E-cadherin表達(dá)缺失是EMT最重要的標(biāo)志［3］。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子近端的E-box序列，抑制其表達(dá)［4］。Hedgehog（Hh）信號(hào)通路是胚胎發(fā)育過程中的重要通路，其異常持續(xù)激活是許多腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移的原因之一［5］。膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白-1（Gli-1）是Hh信號(hào)通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，可作為Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路活化的標(biāo)志［6］。在許多惡性腫瘤中Hh信號(hào)通路的異常活化與EMT的過程密切相關(guān)，但是在NSCLC中兩者的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究通過測(cè)定Hh信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli-1及EMT相關(guān)蛋白在NSCLC中的表達(dá)，分析Hh信號(hào)通路與EMT發(fā)生之間的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本資料 收集天津市胸科醫(yī)院2010年1月至2012年2月經(jīng)手術(shù)切除送檢的NSCLC標(biāo)本67例及癌旁正常余肺組織20例。其中男性43例，女性24例；年齡40～78歲，中位年齡62歲；病理組織學(xué)分型為腺癌26例，鱗癌29例，腺鱗癌12例；TNM臨床分期為Ⅰ期6例，Ⅱ期31例，Ⅲ期26例，Ⅳ期4例。另取NSCLC患者術(shù)中冰凍新鮮組織（癌及配對(duì)癌旁正常余肺組織）標(biāo)本20例，-80℃保存，用于RNA提取。所有患者術(shù)前均未行化療及放射治療，均有完整的病理組織學(xué)和臨床資料，至少由2位病理學(xué)專家進(jìn)行診斷或復(fù)核，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.1.2 主要試劑 兔抗人Gli-1抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司（稀釋濃度為1：100），兔抗人Snail抗體購于美國Abcam公司（稀釋濃度為1：100），兔抗人E-cadherin及鼠抗人N-cadherin抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（稀釋濃度均為1：100），二抗及DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒及Premix Taq酶購自日本Takara公司，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 所有組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定，常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片，每張厚度4 μm。石蠟切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化后進(jìn)行抗原修復(fù)（一抗滴加Gli-1的切片為檸檬酸抗原修復(fù)液修復(fù)，滴加Snail、E-cadherin和N-cadherin的切片為pH值9.0的EDTA修復(fù)液修復(fù)），3%過氧化氫封閉10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加稀釋的一抗，4℃冰箱過夜，二抗37℃水浴孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，以試劑公司提供的陽性切片為陽性對(duì)照，同批次染色。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Gli-1及Snail表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，E-cadherin和N-cad?herin均表達(dá)于細(xì)胞膜及近細(xì)胞膜處的少許胞質(zhì)，胞質(zhì)表達(dá)而包膜不表達(dá)者為陰性（圖1），陽性細(xì)胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級(jí)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)（×400），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。陽性著色強(qiáng)度：無色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，陽性細(xì)胞百分比和陽性著色強(qiáng)度乘積得分：＜3分為陰性組，≥3分為陽性組。

1.2.3 RT-PCR Trizol法提取癌及配對(duì)癌旁正常余肺組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以各組cDNA為模板，進(jìn)行RTPCR，引物序列見表1。反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Taq酶10 μL，RNase free water 6 μL。循環(huán)條件：預(yù)變性 94℃ 5 min；變性95℃ 45 s，退火60℃ 45 s，擴(kuò)增72℃ 45 s，循環(huán)35次；延伸72℃7 min，4℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，用成像系統(tǒng)觀察并照相。電泳圖像應(yīng)用Gel Pro Analysizer 4軟件得出mRNA表達(dá)的相對(duì)灰度值，各組以目的基因與內(nèi)參照基因GAPDH比值表示其mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher's精確概率法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析，對(duì)生存數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)差異性，預(yù)后因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型；RT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)NSCLC中腺癌及鱗癌分化程度的標(biāo)準(zhǔn)

腺癌和鱗癌是NSCLC中最常見的兩種病理組織類型，本研究對(duì)腺癌的分化程度的判讀標(biāo)準(zhǔn)為：附壁樣腺癌為主的為高分化，腺泡狀和乳頭狀腺癌為主的為中分化，實(shí)性和微乳頭腺癌為主的為低分化；對(duì)鱗癌的判讀標(biāo)準(zhǔn)為：高分化鱗癌癌巢中多有角化珠形成，中分化鱗癌中有角化現(xiàn)象但是不形成角化珠，低分化鱗癌細(xì)胞異型性明顯，無角化珠（圖2）。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)NSCLC中Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)（SP法×400）Figure 1 Immunohistochemical staining of Gli-1,Snail,E-cadherin,and N-cadherin in non-small cell lung cancer(SP×400)

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequences of primers for RT-PCR

圖2 不同分化程度NSCLC的病理組織學(xué)（H&E×100）Figure 2 Histopathological features of NSCLC of different differentiation degrees(H&E×100)

2.2 Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin在NSCLC中的表達(dá)

Gli-1及Snail表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，E-cadherin和N-cadherin均表達(dá)于細(xì)胞膜及近細(xì)胞膜處的少許胞質(zhì)，胞質(zhì)表達(dá)而包膜不表達(dá)者為陰性（圖1）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Gli-1、Snail和N-cadherin在NSCLC組織中的表達(dá)高于正常余肺組織，而E-cadherin則在癌組織中低表達(dá)或缺失表達(dá)，NSCLC組織中Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin的陽性表達(dá)率分別為61.19%（41/67）、50.75%（34/67）、56.72%（38/67）、53.73%（36/67），在正常肺組織中的陽性表達(dá)率為20%（4/20）、10%（2/20）、100%（20/20）、5%（1/20），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Gli-1、Snail和N-cadheri mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)水平［（0.933±0.115）vs.（0.656±0.014）vs.（0.255±0.078）］顯著高于正常余肺組織［（0.510±0.208）vs.（0.086±0.362）vs.（0.033±0.043）］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.969vs.t=17.656vs.t=11.196，P＜0.05），E-cadherin mRNA在正常余肺組織中的表達(dá)量（0.811±0.180）則高于癌組織（0.461±0.087），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.823，P＜0.05，圖3）。

2.3 Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

對(duì)67例NSCLC組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析，發(fā)現(xiàn)癌組織中Gli-1及E-cadherin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和臨床分期密切相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、腫物大小和病理分型無相關(guān)性；Snail及N-cadherin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、腫物大小、分化程度和病理分型無相關(guān)性（表2）。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示Gli-1的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.325，P＜0.05），與Snail、N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.379，r=0.490，P＜0.05）；Snail與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.318，P＜0.05）。

2.4 Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

所有患者均有完整的隨訪資料，采用電話查詢獲取隨訪信息，以手術(shù)日期為隨訪開始時(shí)間，2017年2月1日為隨訪截止時(shí)間，NSCLC患者疾病進(jìn)展為截止數(shù)據(jù)。67例患者均獲得隨訪資料，通過Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)比較NSCLC中Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系（圖4）。分析顯示：Gli-1、Snail和N-cadherin高表達(dá)的患者表現(xiàn)出更差的預(yù)后和更低的生存率（P=0.008、0.033、0.041），E-cadherin陰性組的患者較陽性組患者顯示出更差的預(yù)后和更低的生存率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，E-cadherin陰性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表3）。

圖3 NSCLC中Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin mRNA的表達(dá)Figure 3 Detection of Gli-1,Snail,E-cadherin,and N-cadherin mRNA level in non-small cell lung cancer

表2 Gli-1、Snail、E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationship of Gli-1,Snail,E-cadherin,and N-cadherin expression in non-small cell lung cancer with clinical characteristics of patients

表2 Gli-1、Snail、E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表2）Table 2 Relationship of Gli-1,Snail,E-cadherin,and N-cadherin expression in non-small cell lung cancer with clinical characteristics of patients

圖4 Gli-1、Snail、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)與NSCLC患者無進(jìn)展生存時(shí)間的關(guān)系Figure 4 Relationship of Gli-1,Snail,E-cadherin,and N-cadherin expression with progression-free survival of non-small cell lung cancer patients

表3 影響NSCLC患者總生存率的多因素分析Table 3 Analysis of multiple factors affecting overall survival of non-small cell lung cancer

3 討論

肺癌是惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的首要原因，手術(shù)、放化療技術(shù)的進(jìn)步以及靶向藥物等新型治療方法的應(yīng)用使患者的生存時(shí)間有一定的改善，但是NSCLC患者的預(yù)后仍然較差，5年生存率約為15%［7］。因此，亟需進(jìn)一步探索該病的機(jī)制及治療方法。

Hh基因于1980年在果蠅突變體篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在胚胎細(xì)胞的生長和分化以及干細(xì)胞的維持發(fā)揮重要作用，Hh信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲和分化等許多過程［8］。Gli-1是Hh通路中重要且具有激活作用的下游核轉(zhuǎn)錄因子，是Hh信號(hào)通路活化的可靠指標(biāo)。許多研究已表明，在包括腦膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌等多種腫瘤中均存在Hh信號(hào)通路的異常激活［9-10］，與本研究Gli-1在NSCLC中高表達(dá)結(jié)果相一致。本研究顯示Gli-1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和分化程度有關(guān)，表明Hh信號(hào)通路在NSCLC中異常活化，并影響其轉(zhuǎn)移和分化過程。

EMT表現(xiàn)為部分上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和黏附作用，細(xì)胞活動(dòng)性增強(qiáng)并向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［11］，其中E-cadherin的表達(dá)缺失是EMT的標(biāo)志性變化［12］。本研究顯示，在NSCLC組織中E-cadherin表達(dá)較正常組織缺失，而N-cadherin表達(dá)上調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)與Gli-1的表達(dá)具有相關(guān)性（P＜0.05），Gli-1可能通過增強(qiáng)MMP-9或減少E-cadherin的表達(dá)引起腫瘤細(xì)胞之間黏附能力減弱，基底膜的降解增加，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。表明Hh信號(hào)通路通過某種機(jī)制調(diào)控EMT的進(jìn)程，但本研究結(jié)果表明Gli-1的高表達(dá)并不能作為NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，原因可能為EMT的發(fā)生與多種信號(hào)通路相關(guān)，如Wnt、Notch、TGF-β及BMP等信號(hào)通路［13］，Hh信號(hào)通路可能與上述通路交互作用共同影響NSCLC中EMT的進(jìn)程，還需要進(jìn)一步的研究和探討。

參與調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子包括Snail、Twist、ZEB及E2-2等，其中Snail是E-cadherin最重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子。Snail具有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，可通過Smad相互作用蛋白（SIP1）與上皮細(xì)胞黏附分子E-cadherin基因啟動(dòng)子近端的E-box序列結(jié)合，并抑制其表達(dá)［14］。本研究顯示，Snail在NSCLC組織中高表達(dá)，并且與淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，提示Snail可能對(duì)NSCLC的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，并且影響NSCLC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但Snail和N-cadherin的表達(dá)與分化程度并無相關(guān)性，這與一些研究結(jié)果不一致，可能與樣本量不足有關(guān)。Snail和N-cadherin高表達(dá)的患者顯示出較低的無病生存時(shí)間及總生存時(shí)間，但二者同樣不可作為NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，Hh通路的異常激活與NSCLC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，Hh信號(hào)通路通過Gli-1使轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)上調(diào)，從而抑制E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT過程，進(jìn)一步深入研究Hh信號(hào)通路調(diào)控NSCLC中EMT的作用機(jī)制，將為腫瘤的治療提供新的切入點(diǎn)及新的藥物作用靶點(diǎn)。

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