LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌中表達及臨床意義

張靜怡 單麗珠 張潔 張侖

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，流行病學研究推測至2020年全球每年新發胃癌將達80萬例［1］。胃癌的發生發展是一個多因素和多步驟的過程，其中涉及一系列分子生物學的變化，并與遺傳和環境因素密切相關。目前經典的生物標志物和分期系統存在一定局限性，因此探索敏感度和特異度較高的腫瘤標記物，早期發現胃癌，能夠提高胃癌患者生存率［2］。溶酶體相關4次跨膜蛋白B（lysosome-associated transmembrane protein 4β，LAPTM4B）-35基因于2000年首次通過熒光差異顯示技術在原發性肝細胞癌克隆出來，LAPTM4B表達蛋白的N端和C端富含脯氨酸，目前研究認為LAPTM4B-35通過影響細胞信號轉導影響細胞生物學變化［3］。其中LAPTM4B-35基因與多種腫瘤發生發展及生物學行為密切相關，最近研究顯示其與腫瘤的轉移密切相關［4］?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組與細胞外基質蛋白重塑過程密切相關的蛋白酶，目前有26個MMPs被發現［5］。其中MMP-9在調節腫瘤生長、血管生成和腫瘤侵襲轉移方面發揮重要作用［6］。然而目前對LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌中作用及相互作用研究較少，尤其是臨床標本中的應用，因此本研究探討LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006年1月至2011年12月在天津市南開醫院和天津醫科大學腫瘤醫院實施胃癌根治術并具有完整臨床病理資料的胃癌患者隨訪記錄。納入標準：1）病理診斷為胃腺癌；2）接受胃癌根治性R0切除；3）清掃淋巴結數目＞15枚；4）術前檢查無腹腔、肝、肺等遠處臟器轉移；5）具有完整隨訪資料的患者。排除標準：1）術前接受新輔助放化療；2）生存期不足1個月的患者。經篩選共納入152例，患者術后進行病理分型，分級分期參考美國癌癥聯合委員會（AJCC）第7版（2010年）胃癌TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及細胞株mRNA檢測 正常胃黏膜細胞株GES-1及胃癌細胞株HGC-27、SGC7901、MGC803由天津醫科大學腫瘤醫院公共實驗室提供；細胞系保持溫度為37℃、所需環境為5%CO2和95%空氣，RPMI 1640培養基及10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素均購自北京索萊寶生物有限公司。本研究首先對總RNA進行提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測總體RNA，濃度與純度采用紫外分光光度計檢測。以Oligo-dT（購自北京通瑞生物有限公司）為引物，參照20 μL反應體系合成cDNA第一鏈。引物序列為LAPTM4B-35：5'-GGAAGCAGG ACAGCCAACTT/TTATTCTCGATCTCACAACCAAC-3'；MMP-9：5'-AGGACGGCAATGCTGATG/GTGGTGGCGG TTGATGCT-3′；β-actin：5′-CCTGTGGCATCCACGAAA CT/GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。預變性95℃30s，退火30 s，擴展53.5℃30 s，40個循環，最后延伸57.5℃10 min。每個基因進行3次檢測。通過PCR儀自動生成Ct（2-ΔΔCt）值。

1.2.2 免疫組織化學及陽性判定 常規對標本進行烤片、脫蠟、水化，加入檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，將3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶及5%羊血清封閉石蠟標本30 min，加用LAPTM4B-35兔抗人單克隆抗體（1∶50稀釋）或MMP-9兔抗人單克隆抗體（1∶50稀釋）室溫孵育2 h，將石蠟標本用PBS洗滌，然后將辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG室溫滴加孵育30 min，使用DAB顯色，顯色后用流水沖洗，然后用蘇木素復染，最后用乙醇、二甲苯脫水，最后封片鏡檢。未加一抗者為陰性對照。

在光學顯微鏡200倍的視野下進行觀察。陽性細胞率計分標準：視野下陽性細胞＜5%為0分，5%～24%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強度：無染色0分，淡黃色染色為1分，黃色為2分，深棕黃色為3分；采取染色強度和腫瘤細胞陽性率綜合評價染色指數。陽性細胞率計分乘以著色強度所得評價染色指數：≤3分為陰性，＞3分為陽性［7］。

1.2.3 隨訪 對胃癌術后患者定期復查，復查內容包括腫瘤標記物，必要時行胃鏡檢查及CT相關檢查。所有患者術后進行電話隨訪，隨訪截止日期為2017年7月1日。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。胃癌細胞株和正常胃黏膜細胞株中mRNA的表達差異比較采用t檢驗，LAPTM4B-35和MMP-9蛋白表達與臨床病理因素之間的關系采用χ2檢驗，單因素分析采用Ka?plan-Merier法，組間差異分析采用Log-rank法，將單因素有意義的因素納入Cox回歸進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 本組胃癌患者臨床病理情況

本研究共納入152例胃癌患者，患者臨床基本病理特征：男性86例，女性66例；平均年齡59.4歲，≤60歲106例，＞60歲56例；腫瘤最大直徑≤5 cm 102例，＞5 cm 50例；遠端1/3胃癌59例，中1/3胃癌60例，近端1/3胃癌33例；Lauren's分型腸型107例，彌漫性45例；高中分化癌12例，低分化癌140例；淋巴結轉移N分期：N0期48例、N1期28例、N2期30例、N3期46例；腫瘤浸潤T分期：T1期10例、T2期4例、T3期9例、T4期129例；患者5年生存率為43.4%。

2.2 胃癌細胞株及正常胃黏膜細胞中mRNA的表達水平

LAPTM4B-35 mRNA 在 HGC-27（0.34±0.07）、SGC7901（0.29±0.09）和 MGC803（0.37±0.06）胃癌細胞株相對表達量明顯高于GES-1（0.17±0.05）胃黏膜細胞株，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

MMP-9 mRNA在HGC-27（0.39±0.06）、SGC7901（0.23±0.05）和MGC803（0.32±0.07）胃癌細胞株相對表達量明顯高于GES-1（0.09±0.03）胃黏膜細胞株，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 LAPTM4B-35 mRNA與MMP-9 mRNA在不同胃癌細胞株內的表達Figure 1 LAPTM4B-35 mRNA and MMP-9 mRNA expression in different gastric cancer cell lines

2.3 LAPTM4B-35和MMP-9蛋白表達與臨床病理因素的相關性

免疫組織化學結果顯示LAPTM4B-35和MMP-9均在細胞質中表達（圖2）。本組胃癌石蠟標本中LAPTM4B-35陽性表達77例，陽性表達率為50.7%；MMP-9陽性表達56例，陽性表達率為36.8%。相關分析顯示LAPTM4B-35的表達與MMP-9的表達呈正相關（r=0.027，P=0.003）。

結合臨床病理因素相關分析顯示Lauren's分型（P=0.027）和腫瘤浸潤T分期（P=0.006）與LAPTM4B-35表達相關，發現浸潤深度越深，LAPTM4B-35陽性表達越高；腫瘤大?。≒=0.001）和淋巴結轉移N分期（P＜0.001）與MMP-9表達密切相關，發現淋巴結轉移越多，MMP-9陽性表達越高（表1）。

2.4 患者預后生存分析

預后單因素分析結果顯示性別、年齡、Lauren's分型和腫瘤大小與胃癌患者預后無相關（P＞0.05），而腫瘤的部位（P=0.027）、分化程度（P=0.004）、腫瘤浸潤T分期（P＜0.001）、淋巴結轉移N分期（P＜0.001）、LAPTM4B-35表達（P＜0.001）和 MMP-9表達（P＜0.001）與胃癌患者預后相關。Cox多因素分析結果顯示分化程度（HR=4.075，P=0.021）、淋巴結轉移N分期（HR=1.413，P＜0.001）、LAPTM4B-35表達（HR=1.733，P=0.010）與MMP-9表達（HR=1.591，P=0.031）是胃癌患者獨立預后因素（表2）。根據LAPTM4B-35和MMP-9表達進行預后分析發現陰性表達患者預后明顯好于陽性表達患者（圖3）。

根據LAPTM4B-35和MMP-9表達，將患者分為LAPTM4B-35（+）MMP-9（+）30例、LAPTM4B-35（+）MMP-9（-）47例、LAPTM4B-35（-）MMP-9（+）26例、LAPTM4B-35（-）MMP-9（-）49例，預后生存分析發現共表達陽性患者預后最差，而單獨表達陽性患者之間生存無顯著性差異（圖4）。

圖2 免疫組織化學檢測LAPTM4B-35與MMP-9在胃癌組織表達（IHC×400）Figure 2 LAPTM4B-35 and MMP-9 expression in gastric cancer tissue sections(IHC×400)

表1 胃癌患者LAPTM4B-35和MMP-9表達與臨床病理因素之間相關性Table 1 Relationship of LAPTM4B-35 or MMP-9 expression with clinicopathological factors

表1 胃癌患者LAPTM4B-35和MMP-9表達與臨床病理因素之間相關性（續表1）Table 1 Relationship of LAPTM4B-35 or MMP-9 expression with clinicopathological factors

表2 胃癌患者預后單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors influencing OS

表2 胃癌患者預后單因素和多因素分析（續表2）Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors influencing OS

圖3 LAPTM4B-35與MMP-9表達與患者5年OS的關系Figure 3 Relationship of LAPTM4B-35 and MMP-9 expression with 5-year OS

圖4 LAPTM4B-35和MMP-9共表達情況預后生存分析Figure 4 Prognostic survival analysis based on co-expression of LAPTM4B-35 and MMP-9

3 討論

LAPTM4B基因定位于8q22.1，長約50 kb，共含有7個外顯子和6個內含子，DNA全長為2 245個核苷酸。根據其表達產物存在4個穿膜區、有典型的溶酶體定位信號集，因此該基因被命名為溶酶體相關4次跨膜蛋白B，即LAPTM4B［8］。LAPTM4B有2種亞型，LAPTM4B-35和 LAPTM4B-24，研 究發現LAPTM4B-35過表達時抑制細胞凋亡，促進增殖、遷移及侵襲，并通過啟動PI3K/AKT信號通路逆轉耐藥［9］。研究發現LAPTM4B-35基因多態性或過表達與肝癌、肺癌、胃癌等發病風險具有顯著相關性，同時發現LAPTM4B-35高表達于乳腺癌、肺癌、膽囊癌、結腸癌、惡性膠質瘤等腫瘤中［10］。Dong等［11］發現在膠質瘤中Ⅱ級膠質瘤LAPTM4B-35表達低于Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤，推測LAPTM4B-35可能與膠質瘤發展密切相關。Kong等［12］發現在非小細胞肺癌中高表達的LAPTM4B-35基因與腫瘤的復發密切相關。這些研究表明LAPTM4B-35與腫瘤發生和淋巴結轉移密切相關。本研究發現LAPTM4B-35 mRNA在胃癌細胞株中表達明顯高于正常黏膜組織，進一步相關分析發現胃癌組織中LAPTM4B-35蛋白表達與Lau?ren's分型和腫瘤浸潤T分期密切相關，推測高表達的LAPTM4B-35可能與胃癌發展密切相關。

MMP-9已在多種惡性腫瘤中被發現高表達。MMP-9主要通過降解細胞膠質蛋白和Ⅳ、Ⅴ、Ⅺ、ⅩⅥ型膠原蛋白促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［13-14］。在非小細胞肺癌患者中，發現血清中MMP-9明顯較正?；颊呱?，Sampieri等［15］發現MMP-9在結直腸癌細胞中高表達，并且與結直腸癌的侵襲性轉移密切相關。Ruokolainen等［16］發現MMP-9在頭頸部鱗狀細胞癌高表達，然而與臨床病理因素結合，未發現其表達與臨床病理因素之間無相關性。有研究表明在胃癌中MMP-9表達與淋巴結轉移、浸潤、遠處轉移及TNM分期密切相關［6］，推測MMP-9在不同腫瘤中發揮不同作用。本研究同樣發現胃癌細胞株中MMP-9 mRNA表達較高，進一步發現胃癌組織中陽性MMP-9的表達與較大的腫瘤和較多的淋巴結轉移密切相關，因此推測MMP-9可能在胃癌淋巴結轉移發揮作用，與部分研究相一致［17］。

在預后生存方面，Cox多因素分析發現淋巴結轉移、LAPTM4B-35表達和MMP-9表達是本組胃癌患者的獨立預后因素，進一步分析發現LAPTM4B-35陰性表達患者和MMP-9陰性表達患者預后差于LAPTM4B-35陽性表達患者和MMP-9陽性表達患者。本研究還發現本組胃癌患者LAPTM4B-35表達和MMP-9表達呈正相關，推測LAPTM4B-35和MMP-9相互作用，共同促進胃癌的發展。根據LAPTM4B-35和MMP-9共表達進行分析，共表達陽性患者預后最差，共表達陰性預后最好，而表達一種陽性患者之間的預后比較差異無統計學意義，聯合LAPTM4B-35和MMP-9可預測胃癌患者預后，通過檢測LAPTM4B-35與MMP-9表達有助于鑒別高危胃癌患者，從而選擇合適的治療。

本研究尚有不足之處，如LAPTM4B-35是否為MMP-9上游基因尚未明確，以及LAPTM4B-35敲除對胃癌細胞侵襲轉移的影響等需要進一步深入探討。

綜上所述，本研究發現LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌細胞和胃癌組織中高表達，LAPTM4B-35和MMP-9表達可能與胃癌侵襲、轉移和預后密切相關。

[1]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2009[J].CA Cancer J Clin,2009,59:225-249.

[2]Yu Y,Hou L,Song H,et al.Akt/AMPK/mTOR pathway was involved in the autophagy induced by vitamin E succinate in human gastric cancer SGC-7901 cells[J].Mol Cell Biochem,2017,424(1-2):173-183.

[3]Meng F,Chen X,Song H,et al.LAPTM4B down regulation inhibits the proliferation,invasion and angiogenesis of HeLa cells in vitro[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(3):890-900.

[4]Zhang H,Wei Q,Liu R,et al.Overexpression of LAPTM4B-35:a novel marker of poor prognosis of prostate cancer[J].PLoS One,2014,9(3):e91069.

[5]Chambers AF,Matrisian LM.Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis[J].J Natl Cancer Inst,1997,89(17):1260-1270.

[6]Chu D,Zhang Z,Li Y,et al.Matrix metalloproteinase-9 is associated with disease-free survival and overall survival in patients with gastric cancer[J].Int J Cancer,2011,129(4):887-895.

[7]Liu L,Xu X,Jing L,et al.Lysosomal-associated protein transmembrane 4 Beta-35 overexpression is a novel independent prognostic marker for gastric carcinoma[J].PLoS One,2015,10(2):e0118026.

[8]Yang H,Xiong F,Wei X,et al.Overexpression of LAPTM4B-35 promotes growth and metastasis of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo[J].Cancer Lett,2010,294(2):236-244.

[9]Zhang H,Qi S,Zhang T,et al.miR-188-5p inhibits tumour growth and metastasis in prostate cancer by repressing LAPTM4B expression[J].Oncotarget,2015,6(8):6092-6104.

[10]Meng Y,Wang L,Chen D,et al.LAPTM4B:an oncogene in various solid tumors and its functions[J].Oncogene,2016,35(50):6359-6365.

[11]DongX,TamuraK,Kobayashi D,et al.LAPTM4B-35is anovel prognostic factor for glioblastoma[J].J Neurooncol,2017,132(2):295-303.

[12]Kong F,Gao F,Chen J,et al.Overexpressed LAPTM4B-35 is a risk factor for cancer recurrence and poor prognosis in non-small-cell lung cancer[J].Oncotarget,2016,7(35):56193-56199.

[13]Stetler-Stevenson WG.The role of matrix metalloproteinases in tumor invasion,metastasis and angiogenesis[J].Surg Oncol Clin N Am,2001,10(2):383-392.

[14]Du HT,Du LL,Tang XL,et al.Blockade of MMP-2 and MMP-9inhibits corneal lymphangiogenesis[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2017,255(8):1573-1579.

[15]Sampieri CL,de la Pe?a S,Ochoa-Lara M,et al.Expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 in human gastric cancer and superficial gastritis[J].World J Gastroenterol,2010,16(12):1500-1505.

[16]Ruokolainen H,P??kk? P,Turpeenniemi-Hujanen T.Expression of matrix metalloproteinase-9 in head and neck squamous cell carcinoma:a potential marker for prognosis[J].Clin Cancer Res,2004,10(9):3110-3116.

[17]Lin J,Feng J,Jin Y,et al.Pien Tze Huang suppresses VEGF-C-mediated lymphangiogenesis incolorectal cance[J].Oncol Rep,2016,36(6):3568-3576.