絲狀真菌基因敲除的研究現狀

●路則寶

絲狀真菌基因敲除的研究現狀

●路則寶

基因敲除又稱目標基因破壞或目標基因替換（Targeted gene replacement, TGR）。本文主要對近年來基因敲除在絲狀真菌基因功能研究中的應用及優缺點作簡要綜述，以期為科研工作者提供一定參考。

基因敲除；同源重組；RNA干擾

基因敲除是自80年代末以來發展起的一種新型分子生物學技術，指對一個結構已知但功能未知的基因,從分子水平上設計實驗，將該基因去除或取代，通過分析突變體表型而明確基因功能的方法。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。在DNA同源重組（homologous recombination, HR）基礎上發展起來的這種TGR技術,在酵母與哺乳動物細胞中已有廣泛應用。隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組外，新的原理和技術也逐漸被應用。

1 基因的插入突變

基因的插入突變主要是利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞[1]，根據細胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉錄病毒可用于動植物細胞的插入；對于植物細胞而言農桿菌介導的T-DNA轉化和轉座子比較常用。

2 RNA干擾（RNA interference, RNAi）

RNAi引起的基因敲除則是因為少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中，所以RNAi的反應過程也可以用于基因敲除，近年來，越來越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡單方便的方法。

3 絲狀真菌遺傳轉化

目前應用于絲狀真菌轉化的方法有很多，常用的轉化方法主要有：農桿菌介導轉化、電擊法、基因槍法、醋酸鋰轉化法、微注射法等。

3.1 農桿菌介導轉化

近年來,AtMT成為絲狀真菌轉化發展趨勢[2]，在適宜的條件下，A.tumefaciens可將外源DNA導入多種真菌和真菌組織，一些其他體系難于轉化的真菌也可以通過AtMT轉化，與基因槍法相比，AtMT效率更高，而且產生復雜轉化子的數量少，AtMT轉化相對簡單，不需要制備原生質體既可以用于隨機插入突變也可以進行TGR[3]。

3.2 CaCl2/聚乙二醇法

通常是在室溫下，將原生質體置于10～50 mmol/L的CaCl2與高濃度的聚乙二醇中10～30 min。

3.3 電擊轉化

通常是將原生質體（有時用萌發的孢子）置于短暫的高電壓之下,使細胞膜通透性增加，更易于攝取外源DNA。

3.4 基因槍法

在尚未建立原生質體轉化或對于細胞壁成分缺乏了解的真菌，基因槍法是一種有效的轉化方法；另外，對于大麥白粉病菌（Erysiphe graminis, DC）等無法分離培養的專性寄生菌，可以通過與感染的寄主葉片同時轟擊進行轉化。

4 各種方法特點比較分析

CaCl2/聚乙二醇法、電擊轉化在真菌中有廣泛應用，但都存在一個局限,就是需要制備原生質體，原生質體制備[4]是一個復雜的過程，不同真菌細胞壁成分不同，原生質體制備所適用的酶的種類及用量都不同，因此很難用統一的體系來實現。基因槍法是將DNA包裹在金屬或鎢粒子的表面來轟擊完整的真菌組織，與原生質體轉化相比, 基因槍法具有相同或者更高的轉化效率、整和度及遺傳穩定性；可用于基因槍法轉化的真菌組織相對較多，而能夠用于制備原生質體的真菌組織是有限的，因此基因槍法具有優勢，

綜上所述，各種轉化方法都能實現絲狀真菌的TGR，目前，對上述方法進行直接比較的研究很少，一般認為AtMT和基因槍法更適合于TGR，其中AtMT效率相對更高。第一個被轉化的絲狀真菌是粗糙鏈孢霉，目前為止已有上百種絲狀真菌轉化成功，其中有許多種類可被具有不同選擇標記的多種載體所轉化。已轉化成功的絲狀真菌中有工業真菌（如黑曲霉、米曲霉等）、醫用真菌（如產黃青霉、頂頭孢霉）、植物病原真菌（如玉米黑粉菌、小麥全蝕菌等）、殺蟲真菌（如白僵菌、綠僵菌）、真菌上寄生真菌（如哈氏木霉）、食用真菌（如裂褶菌、鬼傘等）、菌根真菌（如卷邊樁菇、漆蠟蘑等）等[5]。

（作者單位：楚雄醫藥高等專科學校）

[1]陳其軍,肖玉梅,王學臣,周海夢.植物功能組研究中的基因敲除技術[J].植物生理學通訊,2004,40:121-126.

[2] Jinkui Yang, Zebao Lu, Yiyong Luo,etal. Involvement of the putative G-protein α subunit gene pngpa1 in the regulation of growth, sensitivity to fungicides, and osmotic stress in Phytophthora nicotianae.Journal of African Microbiology Research,2012,6(3):680～689.

[3] Michielse CB, Arentshorst M, Ram AF, Hondel CA.Agrobacterium-mediated transformation leads to improved gene replacement efficiency in Aspergillus awamori [J]. Fungal Genetics and Biology, 2005,(42):9-19.

[4]宋愛環,李紅葉,劉小紅.指狀青霉(Penicillum digitatum)原生質體制備和再生條件[J].農業生物技術學報,2004,(2):197-201.

[5]許楊,涂追.絲狀真菌基因敲除技術研究進展[J].食品與生物技術學報,2007,26(1):120-126.

路則寶(1980～)，男，碩士研究生，講師，研究方向為微生物與免疫學與教學。