葡萄品種鑒定技術及在遺傳多樣性領域的應用

孫明君，汪東風，高宏偉，陳洪俊，朱水芳，梁成珠

（1中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266000；2山東出入境檢驗檢疫技術中心，山東青島266002；3國家質檢總局國際檢驗檢疫標準與技術法規研究中心，北京100000；4中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所，北京100000）

葡萄品種鑒定技術及在遺傳多樣性領域的應用

孫明君1,2，汪東風1，高宏偉2，陳洪俊3，朱水芳4，梁成珠2

（1中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266000；2山東出入境檢驗檢疫技術中心，山東青島266002；3國家質檢總局國際檢驗檢疫標準與技術法規研究中心，北京100000；4中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所，北京100000）

葡萄品種的鑒定是葡萄種質資源研究和新品種保護的基礎。為了對葡萄種質資源的安全引進和輸出提供技術保障，本文歸納了葡萄品種鑒定中常用技術及其在遺傳多樣性領域的研究進展，總結了在葡萄品種鑒定過程中存在的問題，分析了分子技術在葡萄品種鑒定中的發展趨勢，并對今后品種鑒定工作進行了展望。

葡萄；品種鑒定；種質資源；遺傳多樣性；分子標記

0 引言

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis L.)，為落葉藤本植物，是世界最古老的植物之一。葡萄屬分為真葡萄亞屬(Subgen Euvitis Planch)和圓葉葡萄亞屬(Subgen Muscadinia Planch)。葡萄是世界性的重要經濟水果，其產量約占全世界水果產量的25%。目前，已發現的葡萄屬種質資源有70多個種，已登記的品種有16000個，廣泛分布于溫帶和亞熱帶地區[1]。葡萄屬植物起源廣泛，加上人為引種交換、育種、營養系選種等活動的影響，使得葡萄品種繁多，基因型豐富多樣，而且隨著栽培范圍的擴展，品種不斷增加，形成了諸多各具地方特色的品種群。但是，這種變異豐富、品種繁多的現象，在長期引種栽培過程中，勢必造成大量的同名異物和同物異名，使得葡萄品種鑒定十分困難[2]。

物種資源的保護和利用是生物多樣性公約的重要內容，國際社會正在探討制定物種資源獲取和惠益分享國際制度，生物物種資源的檢驗檢疫將是實施相關制度的技術保障。世界葡萄（酒）的著名產地對葡萄品種的、保存、研究是非常重視。作為重要的生物物種資源，葡萄品種資源的引進和輸出也面臨嚴峻的保護和利用問題。從國外引種時，出口國家對該品種中的每個品系使用代碼標識，同一品種不同品系的葡萄在釀酒品質上差異很大。亟需相關的鑒定技術以便進行種質資源的溯源，這對于后續公正、公平的分享物種資源利用所產生的惠益具有重要意義。葡萄品種鑒定的意義主要體現在3個方面：第一，為葡萄的引種企業提供鑒定服務；第二，為葡萄種植企業的后續選育、釀造提供品系鑒定的技術支撐；第三，為中國釀造葡萄的國際交流通搭建平臺。本文總結了主要的葡萄品種鑒定技術及分子技術在葡萄品種鑒定中的發展趨勢，詳細介紹了葡萄品種鑒定技術在遺傳多樣性研究中的應用進展，對于建立口岸葡萄物種資源的查驗方法和標準提供技術支撐，為種質資源的安全引進和輸出提供技術保障，為葡萄種質資源的出入境監管提供技術參考。

1 葡萄品種鑒定技術研究進展

1.1 形態學鑒定

劉崇懷等[3]對《中國葡萄志》描述的38個中國葡萄屬野生和1個栽培品種，按照《葡萄種質資源描述規范和數據標準》的要求，對18個描述符用代碼量化并進行聚類分析，根據形態特征的相似程度，將中國葡萄屬野生種和歐亞種劃分為8個組和5個亞組。宋真等[4]以成熟葉片為基本材料，運用國際葡萄與葡萄酒組織形態分類方法及技術開發了基于葡萄葉片數字圖像的葡萄品種自動識別軟件，共測試17種釀酒葡萄和3種野生葡萄，識別率達87%。宋軍陽等[5]對原產中國的野生葡萄種和部分栽培品種共13個種30個株系（品種）的花粉形態進行觀察研究，結果表明，除歐美雜交種巨峰葡萄花粉粒為四溝孔型外，其他野生葡萄、歐洲葡萄品種花粉粒均為三溝孔型。

1.2 生物化學鑒定

1.2.1 同工酶鑒定 崔輝梅等[6]對3個葡萄品種莖尖愈傷組織誘導苗的超氧化物歧化酶(SOD)同工酶分析，為體細胞無性系變異在品種改良中的應用提供了依據。呂秀蘭等[7]采用聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，分析了22個葡萄品種的葉片中過氧化物(POD)同工酶酶譜特征。結果表明，22個品種共電泳出6種過氧化物同工酶酶帶，酶譜類型17種，表明POD同工酶酶譜不能將葡萄品種鑒別開來，每種過氧化酶酶譜類型具3～5條酶帶。Blein等[8]在研究葡萄必須發酵過程酵母蛋白質組變化產生不同適應性反應中發現，在葡萄糖發酵途徑同工酶沒有發生共變。S.cerevisiae和S.uvarum中最豐富的同工酶并不相同，這種現象在2個同工酶家族（PFK1/PFK2和TDH1/TDH2/TDH3）中表現顯著。結果表明這2個品種利用不同類型同工酶進行葡萄糖發酵。

1.2.2 蛋白質標記 張玉潔等[9]對葡萄葉片中總蛋白質的雙向電泳技術體系進行了初步探討，得到較為理想的雙向電泳分析結果。黃靜等[10]通過雙向電泳獲得大葉蛇葡萄活性成分蛋白質表征圖譜，為從分子水平研究大葉蛇葡萄活性成分蛋白表達奠定了良好的基礎。Maria等[11]采用差異蛋白質組學方法，通過凝膠電泳結合串聯質譜進行鑒別和量化156個綠色漿果和61個成熟漿果的差異蛋白表達，對于研究葡萄的生物學功能、漿果發育和品質特征起到重要作用。

1.3 DNA指紋圖譜技術

DNA分子標記的鑒定方法是通過反映不同植物品種DNA水平上的差異而進行基因型鑒定和純度分析的。目前已有很多技術成熟的DNA指紋圖譜的鑒定方法，如RAPD、SSR、ISSR等DNA標記，具有操作簡單易行、方便性好等優點，并有應用于植物品種鑒定的優勢。

1.3.1 RFLP標記 Zhou等[12]從具有灰霉癥狀的鮮食葡萄分離得到的75珠葡萄孢，通過其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(20 C)培養基上表現出的特征用3個核基因(G3PDH,HSP60,RPB2)序列進行系統發育分析。根據葡萄對環酰菌胺的敏感性及葡萄RFLP基因的單體型和致病性對所分離的不同種類葡萄孢進行比較。研究表明B.sinoviticola與鮮食葡萄B.cinerea屬同一物種。

1.3.2 RAPD標記 Kang等[13]對37個葡萄品種進行RAPD指紋識別，得到了充足的多態性來區分葡萄品系，這些標記物成為葡萄品系鑒定中一個快速、可靠的工具。Fan等[14]通過18對序列相關擴增多態性引物組合來評估126個來自5個不同地理種群的華北葡萄獨立樣本的遺傳多樣性，分類結果幾乎與種群的地理分步一致。侯鴻敏等[15]以起源于中國的野葡萄12個種23個珠系、歐美雜種6個品種、河岸葡萄3份、15個歐洲葡萄品種共47份材料為試材，采用RAPD技術對葡萄屬植物種質資源遺傳多樣性進行研究。結果表明，歐洲葡萄、歐美葡萄雜種、河岸葡萄與中國野葡萄親緣關系較遠；在中國野葡萄中，山葡萄與其他種親緣關系較遠，刺葡萄次之。張劍俠等[16]以抗寒性存在差異的83份葡萄種質及3個雜交組合為試材，進行了中國野生葡萄抗寒基因RAPD標記的研究。通過對110個隨機引物的篩選，獲得了2個與中國野生葡萄抗寒基因相連鎖的RAPD標記，可用于葡萄抗寒育種的早期分子標記輔助選擇。于華平等[17]針對RAPD技術的特點及其實際應用中易出現穩定性的問題，以葡萄等7種果樹的不同品種為試材，對RAPD技術在鑒定果樹品種中的科學性進行了技術上的驗證與分析。結果表明，理想的反應條件能夠保證RAPD技術具有很好的穩定性，是適用于鑒定果樹品種的簡易與理想的DNA分子標記技術。

1.3.3 AFLP標記 Marián等[18]通過微衛星和標準AFLP分析手段對加利西亞（西班牙西北部最重要的本土葡萄品種）種質資源進行分子識別及對AFLP分析葡萄指紋的方法有效性進行評估。微衛星分析結果與數據庫相一致，并首次提出了應用這種方法分析葡萄品種的分子特性。唐美玲等[19]通過AFLP分子標記方法，應用64對引物組合對山葡萄雌花、雄花和兩性花植株基因池進行篩選。對已知性別的85份山葡萄種質進行盲測，準確率達到97.6%。

1.3.4 ISSR標記 王蕾等[20]利用ISSR標記和葉綠體DNA非編碼區分析36種葡萄種質的遺傳多樣性和系統發育關系，為葡萄種質資源的理論和應用提供了有價值的信息。賴呈純等[21]利用ISSR分子標記技術對95份葡萄品種（系）資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析。通過聚類分析將95份葡萄資源劃分為3大類，分別為歐亞種、歐美雜種和東亞種群，與葡萄傳統分類結果一致。李琳等[22]利用ISSR標記對24份葡萄材料進行了基因組多態性分析。結果表明，美洲雜交種與歐美雜交種、歐亞種葡萄的親緣關系較遠，歐美雜種與歐亞種葡萄之間親緣關系較近。崔鵬等[23]利用ISSR標記研究南方45個葡萄主要栽培品種的遺傳多樣性和親緣關系，明確了遺傳背景。

1.3.5 SSR標記 Sana等[24]用9個核微衛星標記物來鑒別35個野生葡萄品種并探查了突尼斯西北部64個栽培品種。基因型分析表明，突尼斯野生和栽培樣品均保持較高水平的基因變異。栽培和野生型之間的低水平基因流動表明，多數栽培品種并不是直接源于當地野生品種而可能因不同地區自然雜交產生。Natasa等[25]用11個微衛星標記對38個斯洛文尼亞當地品種進行基因分型和遺傳關系評價，表明斯洛文尼亞葡萄品種在歐洲葡萄種質資源中呈現多態性和高水平遺傳多樣性，揭示了與克羅地亞品種關系最近，與法國關系最遠。Anna等[26]通過13個微衛星標記對阿普利亞地區45個葡萄品種分型，并通過與阿普利亞及周邊地區栽培品種的形態學特征進行對比，揭示了所發現新的同物異名是源于其他地區因早期殖民地和歷史上地中海貿易路線的建立而移植傳入的傳統栽培品種。Goran等[27]用11個微衛星標記鑒別76個達爾馬提亞本地葡萄品種，所發現的12個同物異名與之前的基因型進行比較，表明該現象源于同周邊國家的葡萄品種交換。遺傳距離分析顯示存在5個葡萄種群并確認了幾個獨特的葡萄基因池。Dániel等[28]用14個微衛星標記對密蘇里地區7個沙地葡萄種群進行基因分型，評估等位基因多樣性、雜合性及種群結構不同水平下的遺傳分化。發現沙地葡萄與歐亞種葡萄及其他異型雜交被子植物在遺傳多樣性方面有諸多相似，明顯的區分密蘇里州和俄克拉荷馬州的種群，推斷種群分化和遺傳漂變是沙地葡萄的固有特征。Francois等[29]采用微衛星分析對希臘葡萄基因資源特性進行了研究，準確鑒別了希臘栽培葡萄品種并以網絡數據庫的形式收集了可用的葡萄品種學信息及分子數據。Emilia等[30]采用微衛星分析了西班牙西北地區新的同物異名和異物同名葡萄品種，研究中用8對微衛星證實加利西亞存在2個葡萄種群。Pilar等[31]研究了1993年以來伊比利亞半島西北地區種植的22個古老葡萄品種，通過成熟葉片葡萄品種學特征及10對微衛星標記的分析評價表型和基因型變異，對當地古老葡萄品種生物多樣性的保護具有重要意義。Hong等[32]將葡萄表達序列標簽應用于基因分型和遺傳映射，通過分類分析將6447個ESTSSR標記物縮減到1701個不重復序列，并進行葡萄的多態性和雜合性分析。這些EST-SSR功能性標記物對葡萄分型與遺傳映射是一個有益的補充。CLAIRE等[33]從5個不同葡萄屬跨域25個品種評價9個位點的可轉移性。調查顯示用衍生葡萄單一序列重復位點研究葡萄種群是可行的，這些高信息位點在未來葡萄保育研究中將發揮重要作用。Summaira等[34]首次使用基于DNA簡單重復序列標記元件鑒定北美麝香葡萄栽培及雜交品種。14個SSR標記物共鑒定57個品種，通過比較親本與后代共用等位基因來驗證指紋圖譜。對北美麝香葡萄品種多樣性的保護起到一定作用。

1.3.6 SNP標記 Sara等[35]首次通過RNA測序深入了解單核苷酸多態性、物種變異及植物發育階段轉錄組在葡萄漿果發育過程中的基因表達。在葡萄親緣關系推定過程中SNP是一個強大的工具。llaHasna等[36]通過SNP分析鑒定伊比利亞半島葡萄布蘭卡的遺傳網絡，結果表明這個栽培品種在葡萄栽培地域存在相關影響，葡萄牙與西班牙的葡萄栽培之間存在聯系。Michela等[37]通過SNP構建基于錨定細菌的人工染色體鄰接片段的葡萄遺傳連鎖圖。通過數據庫添加SNP標記物引入多態性，顯著提高譜圖量級，對以后在研究葡萄結構和功能基因組、遺傳改良方面提供相關幫助。Katie等[38]開發了一種稱為HetMappS的模塊化方案，解決了采用基因序列分型(GBS)建立遺傳譜圖時產生數據丟失和雜合復雜化問題，在高度雜合物種基因映射中有更廣泛的應用。Francesco等[39]通過22個常見微衛星位點和384個單核苷酸多態性對2273個葡萄品種的分子多樣性類型進行研究。通過比較物候與遺傳的核心種質，表明SNP保留更多的遺傳多樣性同時保留相似的表型變異。Sean Myles等[40-41]開發啟發式算法調用SNP數據，證實了SNP矩陣可提供足夠的分辨率在葡萄品系間、栽培和野生品種間甚至多樣化野生品種間進行區分。Gabriella等[42]通過葡萄18K SNP矩陣分析71個格魯吉亞地區葡萄品種并調查遺傳多樣性水平。通過遺傳結構與多變量分析得到的分類學狀態與品種地理起源結論相一致。遺傳多樣性結構類型證明葡萄的馴化對格魯吉亞地區作物的進化做出了貢獻。Allison等[43]使用雜交強度數據降低了偏差的影響。應用SNP基因分型和葡萄9K SNP矩陣得到的雜交強度數據，確定了偏差的影響并重建葡萄品種間進化關系，證明用雜交強度重建系統發育過程降低了偏差，比基因型調用的系統發育更準確。

2 分子技術在葡萄品種鑒定中的發展趨勢

經過10多年的系統研究和檢測實踐，在品種鑒定中逐漸實現了DNA指紋技術的升級和檢測該體系的標準化，從最初使用RAPD標記技術到目前，基于SSR標記技術的檢測體系日趨成熟，同時開始探索開展第三代分子標記SNP技術在葡萄品種鑒定中的應用研究。分子鑒定技術和理念的提升主要在以下3個方面：（1）從RAPD標記到SSR標記的技術提升；（2）從SSR標記到SNP標記的技術探索；（3）從非功能標記向功能標記的轉變。

DNA分子標記技術的開發，是近年來分子生物學領域研究的熱點。隨著分子生物學理論與技術的迅猛發展，人們必將不斷地開發出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標記。當前，分子遺傳標記的發展呈現出以下5個趨勢：（1）對現有遺傳標記技術進行優化與集成，降低檢測成本，提高檢測效率，組合已有標記技術，同時提高標記的靶向性，使反映的信息專一性更加突出。（2）充分利用基因組結構的共性特征開發新標記，如重復序列、散在保守序列、新基因家族、啟動子保守序列等，利用基因和基因內部模塊“界標”保守序列，挖掘并利用基因組中編碼元件與非編碼序列的保守特征，從而發現更多更穩定、效應更顯著的分子標記。（3）進一步開發揭示新遺傳變異類型的標記，如表觀遺傳差異、表達豐度差異、表達模式差異等。（4）標記開發向高通量、集成式、自動化方向發展，如SNP芯片、變性高效液相色譜DHPLC、基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析(MALDI-TOF)等。（5）同時揭示多層次信息的復合標記，從基因組→轉錄組→蛋白組→代謝組→表型組，各層次信息的不平衡性決定了僅用單層次標記的局限性，使用多層次的標記，更能展示基因的表達調控方法和作用。

3 展望

目前，中國葡萄種植業已跨入世界先進行列，葡萄相關產業被列為中國“十二五”重點發展的農業產業，葡萄種植面積進一步擴大和下游產業發展對葡萄的引種、育種提出了更高更豐富的要求。葡萄品種繁多，后經過長期的引種、馴化、育種和營養系選中，形成了各具特色的栽培品種，使得葡萄品種資源不斷豐富。作為重要的生物物種資源，引種、檢驗檢疫、新品系開發過程中經常遇到的品系鑒定問題，葡萄引進和輸出也面臨嚴峻的保護和利用問題。

葡萄品種鑒定過程中存在的問題主要有：（1）從國外引種的釀造葡萄種質時，出口國家會告知中國企業出口的葡萄的品種，但是對該品種中的每個品系使用代碼標識，同一品種不同品系的葡萄在釀酒品質上差異很大。（2）中國企業對所進口的葡萄苗無法鑒定真偽，這是目前葡萄引種企業急需解決的問題。（3）世界主要的釀造葡萄生產國，如法國、意大利等，都有完備的葡萄品系鑒定的技術；但是中國的葡萄種植業沒有此類技術。因此中國釀造葡萄種植企業無法在國際上平等評判葡萄品系。葡萄種植企業后續的種質資源交流無法有效展開，釀造企業控制葡萄酒的穩定風味存在比較大的困難。

葡萄品種鑒定經歷了從形態學到分子生物學，從外部到內部的過程。幾種遺傳標記在不同的應用中均有自身的優缺點。（1）形態學標記一直是葡萄品種鑒定及葡萄屬植物分類最常用的方法。（2）細胞學鑒定以染色體為基礎，能一定程度反映葡萄各品種間的遺傳差異。（3）同工酶鑒定速度快、操作簡便，但作為基因表達的產物易受環境因素的影響。（4）就常用的分子標記RAPD、AFLP、SSR、ISSR而言，RAPD由于重復性差、不穩定導致其分析結果不理想；AFLP穩定可靠，可用來增加遺傳連鎖圖譜的密度以構建高清晰的圖譜，但由于其成本高，程序繁瑣，對DNA質量要求高，在分析大量群體時很不方便；而SSR標記由于在基因組中廣泛分布，重復性高，多態性豐富，對DNA質量要求低，更適于檢測大量群體，雖然其必須采用特異引物進行PCR檢測，但可以應用SAM、STMP、搜索數據庫等進行SSR引物的查詢；ISSR較SSR更簡單、快速、便宜，兩者目前都是應用較多的分子標記方法，也是進行大量DNA指紋分析、基因多樣性和種質資源評價中較好的技術方法。對于難以鑒定、親緣關系很近的品種或一些芽變品種，需要綜合形態學、生物化學、分子標記技術等多種方法進行鑒定。一些新開發出的分子標記在葡萄上還鮮見應用，隨著技術和設備的進步，有望在今后的鑒定工作中發揮至關重要的作用。

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Identification Technology of Grape Variety and Its Application in Genetic Diversity Study

Sun Mingjun1,2,Wang Dongfeng1,Gao Hongwei2,Chen Hongjun3,Zhu Shuifang4,Liang Chengzhu2
(1Institute of Food Science and Engineering in Ocean University of China,Qingdao 266000,Shandong,China;2Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center,Qingdao 266002,Shandong,China;3General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine Inspection and Quarantine International Standards and Technical Regulations Research Center,Beijing 100000,China;4Institute of Animal and Plant Quarantine Inspection and Quarantine Institution in China,Beijing 100000,China)

Identification of grape varieties is a fundamental work for germplasm resources research and new varieties protection of grape.In order to provide technical support for the safety input and output of grape germplasm resources,the common technology in identification of grape varieties and its research progress in genetic diversity were summarized in this paper.The problems existing in the process of grape variety identification were summarized.We also analyzed the development trend of the molecular techniques in grape variety identification and forecasted varieties identification in future work.

Grape;Variety Identification;Germplasm Resources;Genetic Diversity;Molecular Markers

S-1

A論文編號：casb17010012

國家質檢總局科技計劃項目“釀酒葡萄品系鑒定研究”(2015IK214)。

孫明君，男，1986年出生，在職研究生，研究方向：分子生物學。通信地址：266002青島市南區瞿塘峽路70號山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，Tel：0532-80885661，E-mail：522302003@qq.com。

陳洪俊，男，1961年出生，研究員，博士，研究方向：植物保護、檢疫性有害生物鑒定和有害生物風險分析。通信地址：100000北京市朝陽區西壩河東里18號國家質檢總局標準法規研究中心，Tel：010-84603939，E-mail：chenhj@aqsiq.gov.cn。

2017-01-16，

2017-02-22。