乳鐵蛋白酶標抗體的制備及其酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

李亞璞

（河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081）

乳鐵蛋白酶標抗體的制備及其酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

李亞璞

（河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081）

采用過碘酸鈉法對抗牛乳鐵蛋白抗體進行了辣根過氧化物酶標記，建立了二步式的雙抗體夾心ELISA法，并對市售奶粉樣品進行了測定。結(jié)果表明：所制備的酶標記抗體效價達到了1.6×106，與乳中主要其他蛋白如酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白基本沒有交叉反應(yīng)，特異性較好；將HRP-2B12稀釋105倍，以1%OVA為封閉液、含3%BSA的PBST溶液為酶標抗體稀釋液，在此條件下建立的ELISA方法實現(xiàn)了對奶粉樣品的定性測定。

牛乳鐵蛋白；酶標記抗體；雙抗體夾心；配方奶粉

乳鐵蛋白是人乳中的主要乳清蛋白，在牛初乳中的含量也比較豐富。大量試驗證明，乳鐵蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)[1-2]，既可作為人體營養(yǎng)來源，補充鐵和氨基酸，又具有抗微生物、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功效，被認為是一種新型的抗菌抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品添加劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、飼料等行業(yè)，尤其是在嬰幼兒配方奶粉[3]中使用廣泛。

目前，檢測牛乳鐵蛋白的方法比較多，其中酶聯(lián)免疫吸附法[4]具有成本低、靈敏度高、速度快的優(yōu)勢，但尚未開發(fā)出能夠全面實現(xiàn)準確、快速、重復(fù)性好的乳鐵蛋白ELISA檢測產(chǎn)品。筆者將篩選得到的抗牛乳鐵蛋白抗體2B12進行辣根過氧化物酶（HRP）標記，建立以抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體包被酶標板、以HRP-2B12為檢測抗體的ELISA檢測方法，通過該方法檢測嬰幼兒配方奶粉中的牛乳鐵蛋白含量，從而對奶粉的營養(yǎng)價值進行評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從超市購買不同品牌、不同批次的嬰幼兒配方奶粉10種，待測。

主要試驗試劑有：牛乳鐵蛋白標準品，純度98%（日本進口分裝）；酪蛋白、乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白（Sigma）；辣根過氧化物酶、吐溫-20、甘油（Solarbio）；過碘酸鈉、乙二醇、硼氫化鈉、硫酸銨等（國內(nèi)分析純試劑）；磷酸緩沖液（PBS，pH值7.4，自制）、超純水（自制）。

主要儀器有：移液槍、洗板機（Thermo）、酶標儀（美國 Bio-TEK）、37℃ 恒溫培養(yǎng)箱（SANYO 公司）、低溫離心機（HITACHI）、酶標板（Costar）。

1.2 試驗方法

1.2.1細胞株2B12的復(fù)蘇將細胞株2B12從液氮中取出，迅速放入37～40℃的水浴中溶化1～2 min，然后1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待培養(yǎng)的細胞狀態(tài)較好，細胞數(shù)量達到一定數(shù)值時，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法進行單克隆抗體的制備。

1.2.2細胞株2B12單克隆抗體的制備采用辛酸-硫酸銨法純化抗牛乳鐵蛋白單克隆抗體2B12，并對純化后抗體進行效價、純度及蛋白濃度的測定。

1.2.3辣根過氧化物酶標記單克隆抗體采用過碘酸鈉法[5-6]對單克隆抗體2B12進行辣根過氧化物酶標記，并對標記抗體進行活性測定。以包被緩沖液將牛乳鐵蛋白抗原稀釋后包被，包被濃度1 μg/mL，4℃過夜后用洗液將包被板條洗滌3次，然后將HRP-2B12以1︰200的比例開始進行倍比稀釋，加入到酶標板孔中，100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗滌3次后加入顯色液處理15 min，加入2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，讀取酶標儀讀數(shù)。通過酶標記物的OD280和OD403值，計算此次酶標記抗體的酶標記率。

1.2.4多抗單抗夾心ELISA檢測體系的建立（1）HRP-2B12抗體最適工作濃度的確定。以包被緩沖液將純化的抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體稀釋為1.0 μg/mL，包被酶標板，4℃過夜；洗滌后用封閉液封閉1 h，洗滌后加入1 mg/mL牛乳鐵蛋白標準品溶液，以PBS作為空白對照，37℃溫浴45 min，洗滌后加入不同稀釋倍數(shù)的2B12抗體溶液，37℃溫浴30 min，洗滌后加入底物溶液，37℃顯色15 min，終止反應(yīng)；用酶標儀讀出OD450值，空白孔值較低且陽性孔值在1.5以上所對應(yīng)的濃度即為HRP-2B12抗體的最適工作濃度。（2）不同封閉劑的選擇。抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體包被酶標板，4℃過夜，洗滌后，分為4組：第1組用1%OVA封閉；第2組用3%BSA封閉；第3組用10%小牛血清封閉；第4組未封閉；封閉液100 μL/孔，37℃下反應(yīng)1 h。洗滌后，加入1 mg/mL的牛乳鐵蛋白溶液，37℃溫育30 min，洗滌，以PBS作為空白對照，加入最適濃度的HRP-2B12抗體溶液，每孔100 μL，37℃反應(yīng)30 min，洗滌后加入底物溶液，37℃顯色15 min，終止反應(yīng)，用酶標儀讀出OD450值，比較各組的OD450值和P/C值（P為陽性值，C為空白值），以選擇合適的封閉液。（3）最適酶標抗體稀釋液的選擇。在上述試驗最優(yōu)的基礎(chǔ)上，用不同的抗體稀釋液將酶標抗體稀釋至工作濃度，抗體稀釋液分別為含有10%小牛血清、1%BSA和3%BSA的PBST溶液，然后進行雙抗體夾心試驗。比較各組的OD450值和P/C值，選擇合適的抗體稀釋液。（4）特異性測定。按照所建立的ELISA檢測方法，對乳中其他主要蛋白如酪蛋白、乳白蛋白及β-乳球蛋白進行檢測，同時以乳鐵蛋白標準品為對照，蛋白濃度均為1 mg/mL，以確定所建立方法的特異性。

1.2.5奶粉樣品的實際檢測從超市購買了10種不同的嬰幼兒配方奶粉，編號分別為1～10。奶粉樣品處理方法：天平上稱取1g奶粉樣品，用5 mL 50～60℃左右溫水沖開，離心機上3 000 r/min離心，除去上層脂肪，取100 μL奶樣進行檢測，以此確定奶粉樣品中是否含有牛乳鐵蛋白，檢測結(jié)果與牛奶灌裝標識進行比較，比較兩者的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體的制備及純化

復(fù)蘇抗牛乳鐵蛋白細胞株2B12，細胞株狀態(tài)良好，經(jīng)過擴大培養(yǎng)注射小鼠，制備約得30 mL腹水抗體。經(jīng)過辛酸-硫酸銨法純化測的腹水中蛋白濃度為8.03 mg/mL，采用凝膠成像測得蛋白純度在80%以上。

2.2 酶標抗體特性測定

經(jīng)過直接ELISA法測定，酶標抗體效價為1︰1.6×106，表明酶標抗體活性很高。其中在酶標抗體進行105稀釋時，其OD450值約為1.0，因此將酶標抗體分別稀釋104、105和2×105，以確定最適的工作濃度。計算得此次酶標記率為0.5。

2.3 HRP-2B12抗體最適工作濃度的選擇

如表1所示，當多抗包被濃度為1.0 μg/mL， 將HRP-2B12抗體進行105倍稀釋時，空白對照OD450值較低，P值在1.5以上較為合理，因此確定2B12抗體的稀釋倍數(shù)為105倍。

表1 酶標抗體不同稀釋度對試驗結(jié)果的影響

2.4 不同封閉劑的選擇

如表2所示，4種不同配方的封閉液中，以1%OVA封閉P/C值較大，與CK處理相差不大，封閉效果都比較好。因此，選擇1%OVA作為試驗的封閉液。

表2 不同封閉劑對試驗結(jié)果的影響

2.5 抗體稀釋液的選擇

如表3所示，3種不同的酶標抗體稀釋液，以3%BSA的PBST溶液稀釋酶標抗體，P/C值最大，因此選擇該稀釋液作為酶標抗體的稀釋液。

表3 不同酶標抗體稀釋液對試驗結(jié)果的影響

2.6 特異性檢測

選取牛乳中其他主要蛋白作為抗原，檢測所建立方法的特異性，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，該方法檢測酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白時，測定結(jié)果與空白對照的OD450值比值均＜2.1，反應(yīng)結(jié)果為陰性；檢測乳鐵蛋白標準品時測定結(jié)果與空白對照的OD450值比值≥2.1，反應(yīng)結(jié)果為陽性。這表明該檢測方法的特異性較好。

圖1 不同蛋白質(zhì)對方法的特異性表現(xiàn)

2.7 奶粉樣品的檢測

對奶粉樣品進行了實際檢測，結(jié)果如表4所示。10種奶粉樣品中，6種含有牛乳鐵蛋白的奶粉樣品呈現(xiàn)明顯的陽性結(jié)果，4種不含有牛乳鐵蛋白的奶粉樣品呈現(xiàn)陰性結(jié)果，此結(jié)果與奶粉灌裝標識一致。

表4 奶粉樣品測定結(jié)果

3 討 論

該試驗采用過碘酸鈉法對抗牛乳鐵蛋白抗體進行了辣根過氧化物酶標記，獲得了活性很高的HRP-2B12，酶標記抗體效價達到了1.6×106。建立了二步法的雙抗體夾心ELISA檢測方法：確定HRP-2B12的使用濃度為稀釋105倍，以1%OVA為封閉液、含3%BSA的PBST溶液為酶標抗體稀釋液。以乳中其他主要蛋白如酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白對方法進行驗證，結(jié)果顯示該檢測方法的特異性較好，只對牛乳鐵蛋白產(chǎn)生陽性反應(yīng)。采用該方法對市售嬰幼兒配方奶粉中的牛乳鐵蛋白進行檢測，結(jié)果與灌裝標識一致。與之前建立的檢測方法相比，二步法雙抗體夾心ELISA檢測方法減少了試驗操作步驟，縮短了檢測時間。但是目前該方法只能定性測定，下一步將對方法的靈敏度、準確度和保存期等進行補充和完善，爭取能夠定量檢測樣品中的牛乳鐵蛋白含量。

[1] 曹 陽，包永明，安利佳. 乳鐵蛋白研究現(xiàn)狀[J]. 食品科學(xué)，2002，23（12）：132-138.

[2] Farnaud S，Evans R W. Lactoferrin-a multifunctional peotein with antimicrobial properties[J]. Mol Immunol，2003，40（7）：395-405.

[3] 朱玉英，王存芳. 乳中乳鐵蛋白的研究進展[J]. 中國乳品工業(yè)，2015，43（10）：34-36.

[4] 張 也，劉以祥. 酶聯(lián)免疫技術(shù)與食品安全快速檢測[J]. 食品科學(xué)，2003，24（8）：200-204.

[5] 徐晶晶，李 迪，曹永生，等. 辣根過氧化物酶標記兔抗絲狀噬菌體衣殼蛋白抗體的制備與初步應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013，（3）：114-116.

[6] 鄧小芳. 食品中四種重要過敏原酶聯(lián)免疫檢測方法的研究[D]. 無錫：江南大學(xué)，2012.

（責任編輯：成 平）

Preparation of Enzyme Labeled Antibody and Establishment of a Sandwich ELISA System against Bovine Lactoferrin

LI Ya-pu
（Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050081, PRC）

The anti-bovine lactoferrin antibody was labeled by sodium periodate oxidation method, and a sandwich ELISA system against bovine lactoferrin was developed for determining bovine lactoferrin in infant formula milk power. The results showed that the titer of labeled antibody was over 1:1.6×106, and its specifcity was of almost no cross reactivities with other proteins in milk, such as casein, lactalbumin and β-lactoglobulin. Diluting HRP-2B12 105times, with 1% OVA as sealing fluid, PBST solution containing 3% BSA as enzyme mark antibody, the bovine lactoferrin in infant formula milk power was qualitatively detected by the sandwich ELISA system.

bovine lactoferrin; enzyme labeled antibody; sandwich ELISA; infant formula milk power

book=12,ebook=20

Q945.78

A

1006-060X（2016）12-0012-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.004

2016-09-26

河北省科學(xué)院基金項目（2016022577-6）

李亞璞（1980-），女，河北石家莊市人，副研究員，主要從事免疫檢測技術(shù)研究。