不同消毒劑對苧麻各器官內生菌分離效果的影響

孫向平，陳夢雅，曾糧斌，嚴 準

（1.中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128）

不同消毒劑對苧麻各器官內生菌分離效果的影響

孫向平1，陳夢雅2，曾糧斌1，嚴 準1

（1.中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128）

以1 g/L升汞、2% 次氯酸鈉、10 g/L苯酚、50 /L甲醛、20 g/L高錳酸鉀和1 g/L硝酸銀等6種消毒劑對苧麻的葉、莖、根進行表面消毒處理，通過平板計數法分別對培養12、24 h后苧麻樣品分離出的內生菌數進行統計，結果表明：對于苧麻葉、莖和根不同部位的樣品，分別以70%乙醇2 min+1 g/L硝酸銀1 min、70%乙醇2 min+ 20 g/L高錳酸鉀2 min和70%乙醇2 min+2%次氯酸鈉2 min的消毒處理，內生菌分離效果相對更好；其中，莖部的內生菌生長主要集中在消毒后12～24 h；苧麻成熟期各器官內生菌數目由高到低排列依次為葉＞莖＞根。

內生菌；苧麻；消毒劑；分離

植物內生菌（endophyte）是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙，并與宿主協同進化的微生物[1-3]。植物內生菌具有促生、抗蟲、抗菌等作用，在調節植物生長、促進植物抗病蟲害、抗干旱、固氮等方面有較廣泛的應用，并可作為生物工程菌為植物病蟲害的防治提供新的途徑[4]。

苧麻[Boehmeria nivea（L.）Gaud]，又叫“中國草”，起源于中國，屬蕁麻科苧麻屬的多年生宿根性草本植物[5]。中國是世界上種植和使用苧麻歷史最悠久的國家[6]，國內有關苧麻的研究主要集中在品種改良、遺傳基因、組培快繁、抗性生理、栽培管理等方面[7-8]，而有關苧麻內生菌的研究目前較少。

植物表面消毒是分離植物內生菌的首要步驟，消毒的難點在于既要使表面徹底消毒，又要保證植物體內的內生菌不受傷害[9]。不同的消毒劑類型、消毒劑濃度和消毒時間等均直接影響表面消毒的效果。筆者對不同的表面消毒條件進行比較，以期為苧麻內生菌資源的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試樣品2016年6月上旬，在中國農業科學院麻類研究所沅江試驗基地選擇生長良好、無病害的中苧1號健康植株為取樣材料，取成熟期的根、莖、葉作為試驗樣品。

1.1.2培養基培養基配方：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂15 g/L。用NaOH調pH值至7.2，121℃，滅菌20 min。

1.1.3表面消毒劑供試表明消毒劑有：1 g/L升汞（AR，瀘試）、2%次氯酸鈉（AR，國產）、10 g/L苯酚（AR，國產）、50 g/L甲醛（AR，Greagent）、20 g/ L高錳酸鉀（AR，國產）、1 g/L硝酸銀 （AR，國產）。

1.2 試驗方法

將樣品清洗干凈放置于通風陰涼處，使其表面水分蒸發干燥；采用70%乙醇作輔助表面消毒在前期對苧麻不同器官進行2 min的預消毒處理；分別采用升汞、次氯酸鈉、苯酚、甲醛、高錳酸鉀、硝酸銀對苧麻的葉、莖、根做消毒處理，其中葉的處理時間為1 min，莖和根的處理時間為2 min；消毒后的植物材料用無菌水洗3次，在培養皿中至少晾干1 min；然后用無菌剪刀將樣品剪細，加入10 mL PBS溶液，研磨；取100 μL研磨樣品液涂布。印跡對照為消毒后清洗的無菌水100 μL涂布，環境對照為培養基空白對照。每個處理重復3次，37℃培養12 h、24 h 后計數。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑處理后培養12 h的內生菌分離效果

從表1可以看出，對于苧麻葉樣品，1 g/L升汞、2%次氯酸鈉和50 g/L甲醛消毒處理后均沒有分離出任何內生細菌；而10 g/L苯酚、20 g/L高錳酸鉀和1 g/L硝酸銀消毒處理后，內生菌含量分別約為5.3×102、0.3×102和128×102CFU/g，差異顯著；其中，以1 g/L硝酸銀的消毒效果最為合適，既有效抑制了雜菌的污染，又不影響內生菌的活性。對于苧麻莖樣品，2%次氯酸鈉和50 g/L甲醛處理未能分離到內生菌，而采用1 g/L升汞、10 g/L苯酚、20 g/L高錳酸鉀和1 g/L硝酸銀處理分別分離到0.6×102、2.0×102、1.7×102和0.6×102CFU/g的內生菌落；其中，10 g/L苯酚和20 g/L高錳酸鉀處理的消毒效果最為適宜。對于苧麻根樣品，6種消毒劑處理后均分離到內生菌落，且差異顯著；其中，以2%次氯酸鈉處理分離到的內生菌落最多，達70.3×102CFU/g。試驗中，環境對照處理均為陽性，印記對照處理除50 g/L甲醛處理外，其他處理均沒有染菌。

表1 不同消毒劑處理后苧麻各部位培養12 h時內生菌分離效果的比較

2.2 不同消毒劑處理后培養24 h的內生菌分離效果

由表2可知，與培養12 h的處理相比，培養24 h對苧麻葉和根樣品的內生菌分離影響不大，但對苧麻莖樣品的內生菌分離有顯著影響。培養24 h后，6種消毒劑處理的苧麻莖樣品均分離到不同數量的內生菌，其中以120 g/L高錳酸鉀處理的效果最好，內生菌含量為125.6×102CFU/g，其次為10 g/L苯酚的處理，內生菌含量為77.6×102CFU/g。試驗中，苧麻葉樣品中10 g/L苯酚的印跡對照，以及莖、根樣品中120 g/L高錳酸鉀的印跡對照均受到雜菌的污染，其他處理均沒有染菌。

表2 不同消毒劑處理后苧麻各部位培養24 h時內生菌分離效果的比較

3 結 論

表面消毒的效果影響到后續內生菌的分離鑒定，消毒時間過短或者消毒劑濃度太低，會導致雜菌污染，消毒不徹底；而消毒時間過長或者消毒劑濃度太高，均會影響內生菌活性，導致內生菌分離不全。因此，尋找既能徹底進行表面消毒，又不影響內生菌活性的消毒劑及其用量對內生菌資源的開發利用尤為關鍵。試驗結果表明，對于苧麻葉樣品，采用70%乙醇2 min+1 g/L硝酸銀1 min的消毒處理，內生菌分離效果較好；對于苧麻莖樣品，采用70%乙醇2 min+20 g/L高錳酸鉀2 min的消毒處理，內生菌分離效果比其他處理好；對于苧麻根樣品，采用70%乙醇2 min+2%次氯酸鈉2 min的消毒處理，內生菌分離效果相對更好；苧麻莖中的內生菌生長主要集中在消毒后12～24 h，苧麻成熟期各器官內生菌數目由高到低排列依次為葉＞莖＞根。

[1] Bayman P，Lebron L L，Tremblay R L，et al. Variation in endophytic fungi from roots and leaves of Lepanthes （Orchidaceae） [J].

NewPhytologist，1997，135： 143-149．

[2] Stone J K，Bacon C W，White J F. An overview of endophytic microbes： endophytism defined，Microbial Endophytes[M]. New York： Marcel Dekker，2000. 3-30．

[3] Sirrenberg A，Gobel C，Grond S，et al. Pinformospora indica affects plant growth by auxin production[J]. Physiologia Plantarum，2007，131（4） ： 581-589．

[4] 王志勇，劉秀娟，易 曲. 植物內生菌分離時表面消毒條件的比較[J]. 江蘇農業科學，2014，42（8）：366-367.

[5] 中國農業科學院麻類研究所. 中國麻類作物栽培學[M]. 北京： 農業出版社，1992.

[6] 李宗道. 苧麻生理生化與遺傳育種[M]. 北京： 農業出版社，1989.

[7] 劉飛虎，郭清泉，鄭思鄉，等. 苧麻種質資源研究導論[M]. 北京：中國農業出版社，2002.

[8] 熊和平. 麻類作物育種學[M]. 北京： 中國農業科學技術出版社，2008.

[9] 李軍勤，殷小雯，宋培勇. 南方紅豆杉內生真菌分離時的表面消毒方法探索[J]. 生物技術進展，2014，（6）：443-446.

（責任編輯：成 平）

Effects of Different Disinfectant on the Isolation of Endophytes in Different Organs of Ramie

SUN Xiang-ping1，CHEN Meng-ya2，ZENG Liang-bing1，YAN Zhun1
（1. Institute of Bast Fiber Crops Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, PRC; 2.College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking leaves, stems, roots of ramie as materials, surface disinfection treatments were conducted by six kinds disinfectants as follows: 1g/L mercuric chloride, 2% sodium hypochlorite, 10 g/L phenol, 50 g/L formaldehyde, 20 g/L potassium permanganate, and 1g/L silver nitrate. The number of endophyte was counted after cultured 12 h, 24 h by plate count method. The results showed that: 70% ethanol 2min + 1g/L silver nitrate 1min treatment on ramie leaf surface sterilized endophyte separation better than others; 70% ethanol 2min + 20 g/L potassium permanganate separation surface disinfection is better than other treatments for ramie stem endophyte. 70% ethanol 2 min + 2% sodium hypochlorite for disinfection program is a good separation on ramie root endophyte. The number of bacteria endophyte during mature ramie is leaf ＞ stem＞ root.

endophyte; Boehmeria nivea (L.)Gaud; disinfector; separation

book=10,ebook=18

Q93-335

A

1006-060X（2016）12-0010-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.003

2016-09-09

中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2015-IBFC09）

孫向平（1985-），男，湖南新邵縣人，助理研究員，主要從事植物內生菌及其應用研究。

嚴 準