不同粒型水稻品種遺傳差異的SRAP分子標記分析

鐘 麗，劉冠明，程 誠，陳兆貴

（1.惠州學院生命科學系，廣東 惠州 516007；2.仲愷農業工程學院農學院，廣東 廣州 510550；3.惠州市世紀五豐農業科技股份有限公司，廣東 惠州 516003）

不同粒型水稻品種遺傳差異的SRAP分子標記分析

鐘 麗1，劉冠明2，程 誠3，陳兆貴1

（1.惠州學院生命科學系，廣東 惠州 516007；2.仲愷農業工程學院農學院，廣東 廣州 510550；3.惠州市世紀五豐農業科技股份有限公司，廣東 惠州 516003）

研究利用SRAP標記方法對13種長粒水稻和9種短粒水稻材料進行遺傳差異分析，以探討不同粒型水稻品種的遺傳差異。結果表明：共擴增了Me1～Me15和Em1～Em20兩兩配對形成的300對引物，其中帶型清晰、有4條帶以上的引物161對；161對引物組合共產生1 512條擴增帶，1 244條呈多態性，多態性條帶比率平均為81.9%，說明品種間存在著較豐富的遺傳多態性。聚類分析結果顯示，在遺傳距離0.66處，可將供試材料分為3大類群。

水稻；粒型；分子標記；SRAP；遺傳差異

水稻是人類最重要的糧食作物之一，全世界超過30億人以稻米為主食。因此，水稻的安全生產受到國家的高度重視[1]。提高水稻產量仍是目前水稻育種研究的主要目標。水稻的產量與粒型有密切關系。水稻粒型性狀的遺傳比較復雜，研究表明，粒長受微效多基因控制[2]。石春海等[3]研究表明，粒長的表現在很大程度上是由遺傳決定的，外界環境對其影響相當小。這一結論在秈稻稻米外觀品質性狀的遺傳主效應和環境互作效應分析中可以體現出來。芮重慶等[4]研究表明，粒長的遺傳雖然存在正向部分顯性的現象，但是在很大程度上是由加性效應決定的；同時也可能存在細胞質與細胞核間的互作效應，但未觀察到細胞質和上位效應的影響，其狹義遺傳率高達95.3%。石春海等[5]在早秈稻谷粒性狀遺傳效應的分析研究中指出，加性效應是粒長的主要遺傳規律，其貢獻比率為50.6%～98.4%。

SRAP標記（sequence-based amplified polymorphism）是一種新型的分子標記技術，具有多態性高、重復性好、操作簡單、易測序、引物通用等優點[6-7]，廣泛應用于植物的遺傳基礎研究和育種等領域，并在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、比較基因組學等多個領域都有所進展[8-12]。由于多年來育種家不斷地對水稻資源材料進行定向選擇，目前水稻資源已經形成了較多的衍生系。因此，在進行育種技術創新和優良種質資源收集篩選之前，要充分了解水稻資源的現狀。試驗采用SRAP分子標記技術對部分長粒水稻和短粒水稻進行親緣關系和遺傳差異分析，為進一步研究長粒基因的作用機理打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長粒水稻品系：7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38；短粒水稻品系：1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。全部水稻材料由惠州市世紀五豐水稻研究所提供。

水稻分蘗盛期在每個單株取上部1～3片長約5～10 cm的幼葉葉尖，每種材料取4株植株，即每種材料取4個樣品。樣品采集時，用消好毒的剪刀將水稻幼葉葉尖剪下裝入已標號的密封袋中；樣品采集完后，置于-80℃冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取采用DNA-TPS法提取水稻葉片的DNA[13]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度，將提取的DNA置于4℃冰箱中冷藏待用。

1.2.2 PCR反應選取15條正向引物與20條反向引物（表1，所有引物由北京鼎國昌盛生物技術服務有限公司合成），兩兩配對，組成300對引物對進行PCR，以22種水稻材料的DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系（每個樣品總體積20 μL）： 10 mmol/ L的 dNTP 0.5 μL，含15 mmol/L MgCl2的10×PCR buffer 2 μL，2 μmol/L的引物M 1.5 μL，2 μmol/L的引物E 1.5 μL，5 U/μL的Taq酶0.1 μL，雙蒸H2O 12.4 μL，DNA模板2 μL。混勻放入PCR儀中開始反應。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，35℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個循環；94 ℃ 變性1 min，46 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.2.3銀染和結果記錄電泳結束后，輕輕將玻璃板從電泳槽上拆下，做好標記，取出凝膠，在蒸餾水中漂洗2次；轉移至0.1%AgNO3溶液中染色，在搖床上輕搖10 min；然后將凝膠轉移至蒸餾水中漂洗2次；最后轉入NaOH顯色液中顯色，著色后轉入自來水中保存。記錄帶型結果或凝膠成像。

1.2.4數據統計與分析對SRAP-PCR試驗電泳凝膠成像結果進行記錄，采用人工讀帶的方法，在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶的記為“1”，無DNA條帶記為“0”，缺失的記為“2”，獲得每個引物的Excel 0-1矩陣。應用NTSYS-pc2.10軟件處理并采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析，得到遺傳相似系數，并根據遺傳相似系數建立聚類圖。

表1 試驗所用的SRAP標記引物

2 結果與分析

2.1 DNA提取質量

將TPS法所提取的DNA在0.8 %瓊脂糖凝膠上電泳分離，結果如圖1。電泳顯示的條帶比較整齊明亮，說明DNA沒有降解，純度較好，所以TPS法提取的DNA可以用于SRAP分析。

圖1 0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA純度

2.2 引物的選擇

PCR擴增結果表明，300對引物中，擴增出帶型清晰、有4條帶以上的引物對有161對，另外有57對引物對沒有擴增出任何條帶，有82對引物對擴增出的條帶極少。

2.3 RAP標記的多態性分析

由表2可知，每對引物產生4～18條不等擴增帶，共產生1 512條擴增帶，其中1 244條呈多態性，平均每對引物組合產生9.4條擴增帶和7.7條多態性條帶，多態性條帶比率平均為81.9%。不同引物擴增的多態性比率分布在20.00%～100%之間，而且絕大多數引物擴增的條帶多態性較高，說明水稻的遺傳多樣性分析可以采用SRAP技術。圖2是引物組合Me14/ Em11擴增的22種水稻材料的SRAP圖譜。

表2 SRAP引物組合、擴增帶數及多態性帶數

續表2

圖2 由引物Me14/Em11擴增的22種水稻材料的SRAP圖譜

2.4 聚類分析

根據UPGMA方法進行聚類分析，得到了22種水稻材料的SRAP聚類圖（圖3），從圖3可知，在遺傳距離0.66處，供試材料被分成了3大類群。第一類群包括13個材料，為7-1、7-2、8、10、14-1、14-3、36、38、14-2、35、13、13-1、13-2（圖5中從上至下的順序），包括全部的長粒水稻品種。第二類群有8個材料，為1、15、HP26、HP27、HP85、HP41、HP63、HP25，均為短粒水稻品種。第三類群只有1個材料，是HP11，為短粒水稻品種。

圖3 22種水稻材料遺傳多樣性聚類圖

3 討 論

3.1 SRAP分子標記的可靠性

在作物育種工作中，對品種間的親緣關系和遺傳多樣性的研究具有重要的理論與實踐意義。SRAP分子標記技術之所以能夠區分絕大多數的栽培品種，是因為其具有較高的鑒別能力和引物利用率[14]，與RAPD技術相比，其引物數量雖然較少，但因為SRAP的正向引物和反向引物可以通用，即正向引物可以與任一反向引物配對，同時反向引物也可以與任一正向引物配對，這樣就能在很大程度上提高引物的利用率。SRAP技術沒有AFLP的酶切、連接和擴增雜交等繁瑣步驟，同時該技術引物設計較容易，操作方便，與以往的一些分子標記技術相比，SRAP分子標記技術具有較大的優勢[15-17]。因此，SRAP技術自產生以來就受到了大多數分子生物學家的青睞。對于擴增產物的檢測，研究者可以根據實驗室設備、藥物以及其他實際情況來靈活選擇，因為SRAP不但可以采用比較傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測，還可以采用比較環保的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（該檢測方法采用銀染法染色）。

3.2 長粒和短粒水稻遺傳背景差異

盡管關于水稻粒長的遺傳機理眾說紛紜，但近年來國內外多數研究結果傾向于粒長由多基因控制，并且在表達過程中存在著不完全顯性效應[18]。石春海等[19]用3個長粒品種分別與3個短粒品種兩兩配對進行雜交，結果表明粒長性狀是由多基因控制的數量性狀，并且以加性效應為主。筆者利用SRAP分子標記技術擴增22種不同粒型水稻材料的DNA，發現SRAP擴增的多態性條帶比率平均為81.9 %，多態性比率較高，說明品種間存在著較豐富的遺傳多態性。

試驗中，聚類分析結果顯示，22種水稻材料在遺傳距離0.66處，可分為3大類群，13種長粒水稻材料歸為一類，8種短粒水稻材料歸為另一類，此外，HP11單獨聚為一類，說明HP11與其他品系之間遺傳差異較大。鑒于HP11的獨特性，在雜交育種工作中，選配親本配制雜交組合時，可以考慮選用HP11與其他材料進行雜交組合，以便創造出更多雜交后代變異類型，提高育種工作效率。

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（責任編輯：成 平）

Analysis on Genetic Differences in Rice by SRAP Molecular Markers

ZHONG Li1，LIU Guan-ming2，CHEN Cheng3，CHEN Zhao-gui1
（1. Department of Life Science, Huizhou University, Huizhou 516007, PRC; 2. Agronomy College, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510550, PRC; 3. Huizhou Century Harvest Agricultural Science and Technology Inc, Huizhou 516003, PRC）

Taking thirteen kinds of long grain rice and nine kinds of short grain of rice as materials, the genetic differences between rice varieties were investigated by using SRAP markers method. The results showed that 300 pairs of primers Me1-Me15 and Em1-Em20 pairwise were formed, and 161 pairs of primers were amplifed clear, each of them got more than 4 bands. 161 pairs of primers amplifed 1 512 bands in total, and 1 244 bands were polymorphic bands, with an average rate of 81.9%. It revealed that there were abundant genetic polymorphisms between rice varieties. Cluster analysis indicated that these tested materials could be divided into three groups in the genetic distance of 0.66.

rice; grain type; molecular markers; SRAP; genetic differences

book=5,ebook=13

Q346+.5

A

1006-060X（2016）12-0005-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.002

2016-09-12

2012年廣東省農業科技推廣項目（201201162）

鐘 麗（1994-），女，廣東五華縣人，本科生，生物科學專業。

陳兆貴