中草藥延緩嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星耐藥性的研究

董亞萍，謝欣燕，胡 鯤，楊先樂(lè)

（1.上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

中草藥延緩嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星耐藥性的研究

董亞萍1，謝欣燕2，胡 鯤1，楊先樂(lè)1

（1.上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

為了延緩主要淡水養(yǎng)殖病原菌——嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的耐藥性，以嗜水氣單胞菌ATCC 7966為出發(fā)菌株，評(píng)價(jià)了其對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、復(fù)方硫磺間甲氧嘧啶鈉和硫酸新霉素等抗菌藥物的敏感性；并以恩諾沙星為受試藥物，對(duì)ATCC 7966進(jìn)行低濃度耐藥性誘導(dǎo)，獲得最小抑菌濃度（MIC）提高了256倍的耐藥性菌株。測(cè)定了茉莉花、薄荷葉、連翹等26種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥性的延緩作用，結(jié)果表明：板藍(lán)根、射干、苦參、大青葉、車前草、連翹、黃芩及艾草8種中草藥均具有延緩嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星耐藥性的作用，其中，連翹延緩耐藥性的作用最為明顯。復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)20代接種后，連翹實(shí)驗(yàn)組的耐藥性只上升了2倍（對(duì)照組上升了16倍）。

嗜水氣單胞菌；恩諾沙星；耐藥性；中草藥

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要病原，大量抗生素用來(lái)治療由嗜水氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病[1]，但是隨之而來(lái)的耐藥性問(wèn)題嚴(yán)重威脅了公共衛(wèi)生安全[2]。藥物在目前及將來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間都是防治動(dòng)物病害的主要方式之一[3]。為了降低耐藥性威脅，長(zhǎng)期以來(lái)人們?cè)噲D采取不同措施以延緩耐藥性的產(chǎn)生，如改變藥物劑型、藥物的濃度、用藥的溫度以及用中草藥的方式等。早在1962年就有報(bào)道稱不同濃度的SDS對(duì)金黃色葡萄球菌的R質(zhì)粒有不同程度的消除作用，在濃度為0.6%時(shí)能夠達(dá)到100%的消除率[4]，在42℃高溫的條件下也能消除某些抗生素的耐藥性[5]，黃瑞玉等[6]研究發(fā)現(xiàn)連翹可以抑制多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性。與用中草藥的方法相比，其他方法有很大不足之處，例如消除效果隨溫度及用藥濃度的變化波動(dòng)較大[7]，若控制不當(dāng)會(huì)給生產(chǎn)實(shí)踐帶來(lái)嚴(yán)重的后果。中草藥能在一定程度上延緩藥物抗性的產(chǎn)生，這一特性為水產(chǎn)養(yǎng)殖中日益嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題提出了新的解決思路。此外，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有很大的發(fā)展前景，一方面，大量的中草藥作為國(guó)標(biāo)漁藥被允許在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為殺菌、殺蟲(chóng)及抗病毒藥物使用[8]；另外一方面，相比化學(xué)制劑，中草藥具有良好的安全性，不僅可以達(dá)到抗菌、抑制耐藥性的產(chǎn)生，同時(shí)起到保護(hù)環(huán)境、減少農(nóng)藥殘留的效果[9]。

試驗(yàn)主要以淡水養(yǎng)殖病原菌——嗜水氣單胞菌為研究對(duì)象，通過(guò)低劑量恩諾沙星誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌耐藥菌株，并對(duì)能緩解其耐藥性的中草藥進(jìn)行了篩選及評(píng)價(jià)，以期為解決養(yǎng)殖實(shí)踐中抗菌藥物的耐藥性問(wèn)題提出新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌株嗜水氣單胞菌ATCC 7966（以下簡(jiǎn)稱SS），來(lái)源于ATCC。

1.1.2試驗(yàn)藥物恩諾沙星（CDCT-C13170000），純度≥99.0%；氟苯尼考（CDCT-C13665000），純度≥99.0%；鹽酸多西環(huán)素（CDCT-C13084280），純度為100.0%；硫磺間甲氧嘧啶鈉（CDCT-C16998180），純度≥99.0%；硫酸新霉素（CDCT-C15500900），純度為100.0%。以上藥物均購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

26種用于試驗(yàn)的中草藥：烏梅、敗醬草、板藍(lán)根、射干、大黃、苦參、大青葉、夏枯草、車前草、茉莉花、薄荷葉、連翹、知母、青蒿、白頭翁、黃芩、魚(yú)腥草、艾草、石榴皮、訶子、復(fù)方蒲黃、煙葉、蒼術(shù)、蒲公英、紫草、婁仁，均購(gòu)于奧淼中藥材銷售有限責(zé)任公司。

1.1.3培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯（批號(hào)為022010）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為022021）、MH瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為028050），購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1耐藥菌株的篩選選取了嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 7966為目標(biāo)菌株，對(duì)其進(jìn)行耐藥性篩選，初步選出5種抗生素（恩諾沙星、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、復(fù)方間甲氧嘧啶鈉和硫酸新霉素）耐藥性較強(qiáng)的菌株作為進(jìn)一步試驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2 5種抗生素對(duì)SS的最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定采用二倍稀釋法測(cè)定5種抗生素對(duì)SS的MIC，即將0.2 mL濃度為1 280 μg/mL的藥液分別加入含有1.8 mL濃度為5.0×105 CFU/mL菌液的試管中，至藥物終濃度為0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、1 280 μg/mL，并設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照組，于30℃ 200 r/min搖床振蕩恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。把無(wú)菌生長(zhǎng)稀釋度最大的藥液濃度作為各試驗(yàn)菌株的MIC。

1.2.3耐藥菌株的誘導(dǎo)將SS分別接種到初始濃度為1/2 MIC藥物的MH培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每隔2 d轉(zhuǎn)種1次，將細(xì)菌接種到前次2倍藥物濃度的MH培養(yǎng)基中，測(cè)定其MIC，直至培養(yǎng)菌株的MIC上升至耐藥判定濃度范圍，然后轉(zhuǎn)接于無(wú)藥平板中培養(yǎng)，每天轉(zhuǎn)種1次，連續(xù)傳代12 d，每3 d測(cè)定藥物對(duì)各菌株的MIC，以判斷耐藥菌的穩(wěn)定性，最后將獲得穩(wěn)定耐藥的菌株命名為ATCC7966-RS（以下簡(jiǎn)稱RS）并保種備用。

1.2.4對(duì)SS和RS進(jìn)行中草藥誘導(dǎo)及篩選出具有延緩菌株耐藥性的中草藥對(duì)SS和篩選出的耐藥性較強(qiáng)的RS在添加有中草藥成分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)代，并在普通培養(yǎng)基上穩(wěn)定培養(yǎng)，選取具有抗菌作用的烏梅、敗醬草、板藍(lán)根、射干、大黃、苦參、大青葉、夏枯草、車前草、茉莉花、薄荷葉、連翹、知母、青蒿、白頭翁、黃芩、魚(yú)腥草、艾草、石榴皮、訶子、復(fù)方蒲黃、煙葉、蒼術(shù)、蒲公英、紫草、婁仁等26種中草藥，對(duì)進(jìn)行過(guò)中草藥誘導(dǎo)的菌株進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)。

（1）中草藥有效成分的提取：采用煎煮法對(duì)中藥進(jìn)行提取[10]。準(zhǔn)確稱取中藥飲片50 g，分別加入清水，水量高出飲片約2～3 cm（質(zhì)重的藥物加水較少，質(zhì)輕的藥物加水略多），浸泡30 min，一煎、二煎、三煎的加水量逐步遞減。先以武火煮沸，再調(diào)用文火保持微沸狀態(tài)。一煎沸后煎煮20 min，二煎沸后煎煮15 min，三煎沸后煎煮10 min。將所有的濾液混合，濃縮至50 mL，使藥物的最終濃度為1 g/mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，流通蒸汽滅菌20 min。冷卻后放入4℃冰箱短期備用。

（2）中草藥對(duì)RS耐藥菌株的誘導(dǎo)：將RS和SS分別接種到含中草藥濃度為30 mg/mL和不含中草藥的MH培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，其中RS接種到含有中草藥培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的作為試驗(yàn)組，其他組為對(duì)照組。每天轉(zhuǎn)種1次，每隔5代測(cè)定藥物對(duì)各菌株的MIC，觀察MIC有無(wú)變化。

（3）延緩耐藥性驗(yàn)證試驗(yàn)：在上述試驗(yàn)中篩選出來(lái)的具有回復(fù)突變作用的中草藥，選取其中效果較好的幾種，同時(shí)考慮到在養(yǎng)殖行業(yè)允許使用、并且常用的2種分別是黃芩和苦參，將以上中草藥進(jìn)行延緩耐藥性驗(yàn)證試驗(yàn)。在試驗(yàn)組的50 mL MH液體培養(yǎng)基中分別加入濃度為30 mg/mL中草藥，而對(duì)照組則不加任何中草藥；再在各組的培養(yǎng)基中加入最小抑菌濃度的抗生素，完成試驗(yàn)所需培養(yǎng)基的配制。將敏感菌株分別接種到以上培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每天轉(zhuǎn)種1次，測(cè)定其MIC來(lái)驗(yàn)證中草藥延緩耐藥性的效果。

（4）具有延緩耐藥性作用的中草藥的復(fù)篩：將中草藥分為5個(gè)處理組，分別是對(duì)照組（不含中草藥）、1（連翹）、2（黃芩）、3（苦參）、4（板藍(lán)根）；在1～4組的50 mL MH液體培養(yǎng)基中分別加入濃度為30 mg/mL中草藥，而對(duì)照組則不加任何中草藥；再在5個(gè)組的培養(yǎng)基中加入濃度為0.25 μg/mL（MIC）恩諾沙星。將SS分別接種到5個(gè)處理組的含有藥物的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每天轉(zhuǎn)種1次，在傳到第10、20代時(shí)分別測(cè)定5個(gè)試驗(yàn)組的嗜水氣單胞菌MIC的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 模式藥物的篩選以及耐藥菌株的誘導(dǎo)

經(jīng)檢測(cè)，恩諾沙星、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、復(fù)方間甲氧嘧啶鈉和硫酸新霉素對(duì)SS的MIC分別為0.25、2、8、1和1 μg/mL。其中，SS對(duì)恩諾沙星最為敏感，最小抑菌濃度為0.25 μg/mL。因此，試驗(yàn)將恩諾沙星作為模式藥物來(lái)進(jìn)行下一步的耐藥誘導(dǎo)及延緩試驗(yàn)。以恩諾沙星作為受試藥物，對(duì)SS進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代12 d之后，敏感菌株的MIC由最初的0.25 μg/mL升高到64 μg/mL，MIC提高了256倍，且經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)的耐藥性可以保持。

2.2 具有延緩耐藥性作用中草藥的初篩

從表1可以看出，選取初步篩選的26種中草藥進(jìn)行試驗(yàn)，在傳到第10代時(shí)測(cè)定其MIC，RS分別經(jīng)板藍(lán)根、射干、苦參、大青葉、車前草、連翹、黃芩、艾草等8種中草藥誘導(dǎo)之后，其MIC分別是16、32、32、32、32、16、32、32 μg/mL。而其他18種中草藥誘導(dǎo)后的MIC則沒(méi)有發(fā)生變化。初步篩選結(jié)果表明，8種中草藥具有延緩嗜水氣單胞菌耐藥性的作用，分別是板藍(lán)根、射干、苦參、大青葉、車前草、連翹、黃芩、艾草。

表1 26種中草藥對(duì)耐藥菌株RS作用前后MIC的變化

經(jīng)上述結(jié)果對(duì)比，連翹和板藍(lán)根作用前后的MIC變化最為明顯，均從64 μg/mL降低到16 μg/mL，而經(jīng)其他6種中草藥作用后的MIC均從64 μg/mL降低到32 μg/mL。相比于其他中草藥，連翹和板藍(lán)根的延緩作用效果較強(qiáng)。

2.3 具有延緩耐藥性作用中草藥的復(fù)篩

由表2可知，SS菌株在沒(méi)有任何中草藥的作用下（對(duì)照組），在添加恩諾沙星的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)20代的接種后，MIC由原來(lái)的0.25 μg/mL上升到4.0 μg/mL，是初始的16倍；2、3、4組的MIC由原來(lái)的0.25 μg/mL上升到1.0 μg/mL，是初始的4倍；而1組在有連翹的作用下，經(jīng)過(guò)20代的接種后，MIC由原來(lái)的0.25 μg/mL上升到0.5 μg/mL，僅為初始MIC的2倍。由此表明，這4種中草藥均有延緩耐藥性的作用，其中連翹的延緩作用最明顯。

表2 SS菌株在中草藥與抗生素同時(shí)作用前后MIC的變化（μg/mL）

3 結(jié)論與討論

3.1 嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星等的耐藥性

嗜水氣單胞菌作為一種致病性較強(qiáng)的革蘭氏陰性菌，廣泛分布在河口、淡水及沿海等水域[11]，能夠引起流行性疾病的爆發(fā)[12]，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[13]。在生產(chǎn)實(shí)踐中常用氟喹諾酮類藥物來(lái)防治革蘭氏陰性菌引起的疾病，其中恩諾沙星是嗜水氣單胞菌最為敏感的藥物，同時(shí)也是最常用的，對(duì)該致病菌有較好的抗菌作用[14]。有研究表明，氟喹諾酮類對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果比四環(huán)素類強(qiáng)[15]，但是在實(shí)際用藥過(guò)程中如果沒(méi)有掌握好殺菌濃度，前者較后者更易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性[16]。洪經(jīng)等[17]對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的40株嗜水氣單胞菌進(jìn)行了多種抗生素類的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示耐藥性問(wèn)題普遍存在，并且都有不同程度的多重耐藥現(xiàn)象。Brook等[18]和陳誼鴻等[19]研究表明，在用氟喹諾酮類藥物治療嗜水氣單胞菌引起的疾病時(shí)，由于抗生素的劑型、劑量不同均能引起不同程度的交叉感染，使該病的治療變得更加困難。

3.2 延緩耐藥性的方法

國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究大都集中在嗜水氣單胞菌耐藥的機(jī)制及機(jī)理等方面，近年來(lái)研究方向慢慢轉(zhuǎn)向關(guān)于耐藥性的預(yù)防和控制方面。大量文獻(xiàn)顯示，中草藥具有抑制有害菌生長(zhǎng)的作用，也可以消除耐藥質(zhì)粒[20-21]。韋嬪等[22]發(fā)現(xiàn)五倍子可以降低大腸桿菌耐藥性，從而恢復(fù)該菌對(duì)抗菌類藥物的敏感。陳晴等[23]研究表明黃柏不僅能抑制MRSA，同時(shí)還能消除其耐藥質(zhì)粒。有研究者用化學(xué)、物理等方法通過(guò)阻礙染色體或者質(zhì)粒的復(fù)制、改變細(xì)胞膜的通透性以及抑制相關(guān)蛋白的合成來(lái)達(dá)到消除其耐藥性的目的[24-30]，但是與中草藥消除的方法相比較，前者會(huì)受溫度、鹽度等生產(chǎn)條件的影響從而效果并不穩(wěn)定。近年來(lái)對(duì)中草藥的研究日益增多，與抗生素配合使用將成為生產(chǎn)實(shí)踐的一大亮點(diǎn)。

試驗(yàn)選取初步篩選的具有抑菌作用的26種中草藥進(jìn)行延緩耐藥性試驗(yàn)，結(jié)果顯示有8種中草藥具有延緩作用，以連翹的效果最為明顯，此結(jié)果驗(yàn)證了中草藥具有延緩細(xì)菌耐藥性的結(jié)果，與房文紅等[31]研究黃芩苷與甘草酸對(duì)恩諾沙星在異育銀鯽體內(nèi)代謝的影響的結(jié)果一致。由此建議在生產(chǎn)實(shí)踐中可以將中草藥和抗生素類藥物結(jié)合使用來(lái)治療嗜水氣單胞菌引起的疾病。這不僅為有效的防治該病提供了新的方法，同時(shí)還能延緩病菌耐藥性的產(chǎn)生。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Effects of Chinese Herbal Medicine on Aeromonas hydrophila Resistance on Enrofloxacin

DONG Ya-ping1，XIE Xin-yan2，HU Kun1，YANG Xian-le1
（1. State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, PRC; 2. School of Life Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510265, PRC）

In order to slow down the development of drug resistance of Chinese herbal medicine on Aeromonas hydrophila, a major pathogen bacterium in aquatic animal, the sensitivity of Aeromonas hydrophila on Enrofoxacin, Florfenicol, Doxycycline hydrochloride, Compound Sulfamonomethoxine Sodium and Neomycin Sulphate was evaluated. Using Enrofoxacin as the model drug, ATCC7966 was induced by low concentrations of drug resistance, the minimum inhibitory concentration was rose 256 fold. Twenty six kinds of Chinese herbal medicine were determined to eliminate resistance of Ah, such as jasmine, mint leaves, forsythia and so on. The results revealed that Radix Isatidis, Rhizoma Belamcandae, Flavescent Sophora Root, Dyers Woad Leaf, Plantain, Forsythia, Scutellaria and Wormwood can delay the resistance of Ah on Enrofoxacin, and Forsythia had obviously elimination effect on Aeromonas hydrophila resistance. The result of re-sieving test showed that the drug resistance of Forsythia was increased by 2 fold (compared with 16 fold in control group) after 20 generations inoculation.

Aeromonas hydrophila; Enrofoxacin; resistance; Chinese herbal medicine

book=1,ebook=9

S941

A

1006-060X（2016）12-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.001

2016-09-27

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字[2014]3-4號(hào)）；公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)專項(xiàng)（201203085）；國(guó)家自然資源平臺(tái)項(xiàng)目;上海海洋大學(xué)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)資助項(xiàng)目

董亞萍（1991-），女，河南新鄉(xiāng)市人，碩士研究生，主要從事魚(yú)類藥理學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)研究。

胡 鯤