干擾趨化因子CC受體-2調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路抑制人口腔黏膜上皮細(xì)胞系增殖的機(jī)制

趙 永 程志芬 玄延花

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院口腔科，河南 南陽 473000)

干擾趨化因子CC受體-2調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路抑制人口腔黏膜上皮細(xì)胞系增殖的機(jī)制

趙 永 程志芬1玄延花2

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院口腔科，河南 南陽 473000)

目的探討干擾趨化因子CC受體(CCR)2基因的表達(dá)對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法Western印跡檢測CCR2在口腔黏膜下纖維性變(OSF)中的表達(dá)；用CCR2的siRNA轉(zhuǎn)染人口腔黏膜上皮細(xì)胞系(HOMC)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后用Western印跡檢測各組細(xì)胞中CCR2蛋白表達(dá)；細(xì)胞增殖與活性檢測(CCK8)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖；Western印跡檢測p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化(p)-p38MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果CCR2在OSF組織中的表達(dá)顯著高于正常口腔黏膜組織(P<0.01)；陰性對(duì)照(NC)-siRNA組CCR2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率及p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CCR2-siRNA組CCR2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率及p-p38MAPK蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論CCR2在OSF中高表達(dá)，抑制CCR2的表達(dá)可通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路抑制HOMC的增殖。

趨化因子CC受體-2；口腔黏膜下纖維性變；口腔黏膜上皮細(xì)胞；增殖

口腔黏膜下纖維性變(OSF)是一種發(fā)生于口腔黏膜的隱匿性、慢性口腔黏膜病變〔1〕，不僅限制了大量臨床口腔修復(fù)治療，同時(shí)有癌變潛能，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1是β類趨化因子家族中的一員，參與炎性細(xì)胞的激活及趨化過程，趨化因子CC受體(CCR)2是MCP-1的主要受體〔2〕。研究顯示，CCR2在多種纖維化病變、全身炎性病變、腫瘤、口腔黏膜組織及OSF組織中高表達(dá)〔3，4〕。但目前關(guān)于CCR2對(duì)OSF的影響還未明確。本研究旨在探究抑制CCR2表達(dá)對(duì)人口腔黏膜上皮細(xì)胞系(HOMC)增殖的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2015年1月至2016年12月南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院口腔科收治的患者30例，均經(jīng)臨床及病理確診、無其他系統(tǒng)疾病、未經(jīng)特殊治療且無其他口腔黏膜疾病，取口腔頰黏膜的病變組織作為實(shí)驗(yàn)組。30例對(duì)照組為同期在該院進(jìn)行第3顆磨牙及外傷清創(chuàng)修剪不整齊頰黏膜組織時(shí)獲得。患者、家屬均知情同意。HOMC購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2主要試劑和儀器 D-KSFM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化(p)-p38MAPK抗體均購自美國abcam公司；轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖與活性檢測(CCK8)增殖試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices。

1.3CCR2在OSF中的表達(dá) 提取兩組總蛋白后用BCA試劑盒定量蛋白。取40 μg蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳后電轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜，封閉后4℃孵育，均按照1∶1 000稀釋的CCR2和GAPDH抗體過夜，加入二抗，室溫孵育2 h。根據(jù)電化學(xué)發(fā)光(ECL)化學(xué)試劑盒的說明進(jìn)行顯影，用Quantity one軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HOMC在含有10%胎牛血清(FBS)及1%雙抗的D-KSFM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，按照Invitrogen 公司的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法將合成的不具有干擾作用的陰性對(duì)照siRNA(NC-siRNA)及干擾CCR2表達(dá)的siRNA(CCR2-siRNA)轉(zhuǎn)染至HOMC內(nèi)，設(shè)定未經(jīng)特殊處理的細(xì)胞為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照試劑盒操作。收集培養(yǎng)48 h的3組細(xì)胞，檢測細(xì)胞中CCR2的蛋白表達(dá)。

1.5細(xì)胞增殖檢測 以每毫升含有3×104個(gè)細(xì)胞每孔加200 μl接種3組細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)48 h后每孔加入CCK8液10 μl，37℃孵育0.5～2.0 h，酶標(biāo)儀490 nm測定吸光度A并計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A/對(duì)照組細(xì)胞A)×100%。

1.6Western印跡檢測p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞中的蛋白，按照1.3方法檢測各組細(xì)胞中p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CCR2在OSF組織中的表達(dá) CCR2在OSF組織(0.255±0.034)中的表達(dá)顯著高于正常口腔黏膜組織(0.115±0.023，P<0.01)。

2.2CCR2-siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CCR2的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖的影響 NC-siRNA組CCR2蛋白表達(dá)(0.349±0.047)及細(xì)胞存活率(93.82±5.32)%與對(duì)照組〔(0.345±0.043)、(94.73±4.81)%〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CCR2-siRNA組〔(0.103±0.025)、(65.91±6.64)%〕均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.3抑制CCR2的表達(dá)對(duì)p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 NC-siRNA組p38MAPK(0.256±0.036)、p-p38MAPK(0.096±0.012)蛋白表達(dá)與對(duì)照組(0.255±0.036)、(0.097±0.015)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CCR2-siRNA組p-p38MAPK(0.023±0.011)蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，p38MAPK(0.253±0.035)蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討 論

OSF是一種進(jìn)行性硬化病變，目前認(rèn)為其發(fā)生與營養(yǎng)不良、免疫、咀嚼檳榔、遺傳等多種因素有關(guān)〔5〕。CCR2屬于G蛋白耦聯(lián)受體，在樹突細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞的表面表達(dá)〔6〕。研究顯示，敲除CCR2基因的小鼠血腦屏障通透性、腦梗死面積及腦水腫的形成明顯減少〔7〕。在口腔黏膜組織中CCR2高表達(dá)〔8〕。本研究檢測CCR2在OSF組織也高表達(dá)。

RNA干擾能特異、高效地抑制目的基因表達(dá)，是目前研究基因功能的新方法，已得到廣泛應(yīng)用〔9〕。研究顯示，沉默CCR2的表達(dá)能顯著抑制人高轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究結(jié)果顯示沉默CCR2能顯著抑制HOMC的增殖。

p38MAPK信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路中重要的一員，是參與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要通路，被刺激信號(hào)激活后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程。研究顯示，p38MAPK信號(hào)通路的阻斷可明顯減低炎癥反應(yīng)，減輕缺血再灌注損傷。抑制p38MAPK的表達(dá)可阻止人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。本研究結(jié)果顯示，抑制CCR2的表達(dá)能顯著下調(diào)p-p38MAPK蛋白表達(dá)。

1Idrees F，Patel P，Newaskar V，etal.Surgical defect coverage in oral submucous fibrosis patients with single-stage extended nasolabial flap〔J〕.Oral Maxillofac Surg，2016；20(4)：411-5.

2Graupera I，Solà E，F(xiàn)abrellas N，etal.Urine monocyte chemoattractant protein-1 is an independent predictive factor of hospital readmission and survival in cirrhosis〔J〕.PLoS One，2016；11(6)：e0157371.

3Sun RL，Huang CX，Bao JL，etal.CC-chemokine ligand 2 (CCL2) suppresses high density lipoprotein (HDL) internalization and cholesterol efflux via CC-chemokine receptor 2 (CCR2) induction and p42/44 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation in human endothelial cells〔J〕.J Biol Chem，2016；291(37)：19532-44.

4Christopher AF，Gupta M，Bansal P.Micronome revealed miR-19a/b as key regulator of SOCS3 during cancer related inflammation of oral squamous cell carcinoma〔J〕.Gene，2016；594(1)：30-40.

5Joshi S，Kamalapur M，Patil P，etal.2089208 Ultrasound evaluation and grading of oral submucous fibrosis〔J〕.Ultrasound Med Biol，2015；41(4)：S14-5.

6Talbot J，Bianchini FJ，Nascimento DC，etal.CCR2 expression in neutrophils plays a critical role in their migration into the joints in rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Rheumatol，2015；67(7)：1751-9.

7O′Connor T，Borsig L，Heikenwalder M.CCL2-CCR2 signaling in disease pathogenesis〔J〕.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2015;15(2)：105-18.

8Souto GR，Nunes LF，Tanure BB，etal.CD1a+ dendritic cells in oral lichen planus and amalgam lichenoid reaction〔J〕.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2016;121(6)：651-6.

9胡述提，金 冰，林 濤.RNA 干擾 K-ras 基因?qū)Ψ蜗侔?H441 細(xì)胞 EGFR-TKI 耐藥性的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015;35(11)：2923-4.

10Mandal RK，Agrawal T，Mittal RD.Genetic variants of chemokine CCL2 and chemokine receptor CCR2 genes and risk of prostate cancer〔J〕.Tumor Biol，2015;36(1)：375-81.

R78

A

1005-9202(2017)23-5792-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.018

吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字〔2016〕第266號(hào))

1 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

2 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研部

玄延花(1973-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要從事病理學(xué)研究。

趙 永(1975-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事口腔疾病的研究。

〔2017-09-25修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)