鐵蛋白輕鏈在前列腺癌中的表達(dá)及意義

陳寧 陳晨 李治國(guó) 曹鳳宏△

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科；2華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063000 )

鐵蛋白輕鏈在前列腺癌中的表達(dá)及意義

陳寧1陳晨1李治國(guó)2曹鳳宏1△

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科；2華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063000 )

目的 研究FLC在前列腺癌與前列腺增生中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)前列腺癌和前列腺增生患者病理切片進(jìn)行組化檢測(cè)；采用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)收集的前列腺癌和前列腺增生患者術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行蛋白定量。結(jié)果 FLC蛋白在前列腺癌和前列腺增生中過(guò)表達(dá)率分別是63.3%和20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；FLC蛋白在年齡、術(shù)前PSA、前列腺體積、Gleason評(píng)分、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移各分組中FLC蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。前列腺癌組與前列腺增生組FLC蛋白表達(dá)水平分別為(1.52±0.27)和(0.41±0.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 FLC蛋白在前列腺癌中高表達(dá)，可以作為前列腺癌新的診斷手段；FLC蛋白在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

鐵蛋白輕鏈； 前列腺癌； 免疫組化； 蛋白質(zhì)印跡法

前列腺癌與前列腺增生之間存在著大量差異蛋白，課題組挖掘出研究較少或未曾研究的差異蛋白，鐵蛋白輕鏈蛋白(ferritin light chain, FLC)就是其中之一。我們收集前列腺癌與前列腺增生患者病理切片及術(shù)后標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)及蛋白質(zhì)印跡法(Westen blot)檢測(cè)前列腺癌組和前列腺增生組中FLC蛋白表達(dá)情況。

1 資料和方法

1.1 一般資料 從華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院收集2007年1月至2014年10月前列腺癌患者及2013年1月至2014年10月前列腺增生患者臨床資料，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法抽取前列腺癌患者和前列腺增生各30例，最后從華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科獲得30例前列腺癌和30例前列腺增生患者病理切片。前列腺癌患者年齡51～88歲，平均(73.10±8.47)歲，血清PSA水平0.89～102.10ng/mL，平均(50.99±37.02)ng/mL；前列腺體積26.20～142.30cm3，平均(58.22±29.13)cm3。患者術(shù)前均未經(jīng)抗雄激素及放療處理，行手術(shù)治療，術(shù)后病理報(bào)告均為：前列腺腺癌。臨床分期和病理分期采用2002年AJCC的TNM分期系統(tǒng)。前列腺增生患者年齡55～90歲，平均(72.10±8.98)歲；血清PSA水平0.36～29.86ng/mL，平均(5.38±7.17)ng/mL；前列腺體積23.16～154.77cm3，平均(67.68±29.28)cm3。行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)治療，術(shù)后病理報(bào)告均為：良性前列腺增生。主要試劑為FLC山羊多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Polink-2 plus?免疫組化檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)GBI公司，內(nèi)參基因β-actin購(gòu)自美國(guó)AmeriBiopharma公司；二甲苯、梯度酒精、檸檬酸修復(fù)液，1×電泳緩沖液、半干轉(zhuǎn)液、TBST等實(shí)驗(yàn)試劑由華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法 (1)免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟：恒溫烤箱中烤片，二甲苯及梯度酒精脫蠟、脫水，3%過(guò)氧化氫抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，檸檬酸修復(fù)液高壓修復(fù)抗原，滴加一抗FLC(1∶250)4 ℃過(guò)夜；第2天，PBS沖洗3次，滴加聚合物輔助劑(試劑1)，37 ℃恒溫箱中孵育25 min，PBS沖洗3次，滴加PV-9003(試劑2)，37 ℃恒溫箱中孵育25 min，PBS沖洗3次,顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化液、清水中返藍(lán)，經(jīng)梯度酒精和二甲苯脫水、透明及樹(shù)脂封片完成免疫組化染色操作。免疫組化評(píng)分為染色程度：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分級(jí)從0～3，0分為無(wú)；1分為1～30%；2分為31%～60%；3分為>60%。染色強(qiáng)度：分級(jí)從0～3，0分為無(wú)色、1分淡黃色、2分棕黃色、3分棕褐色。用兩者評(píng)分相乘得最終評(píng)分，0～3分認(rèn)為是低表達(dá)(-)，>3分認(rèn)為是過(guò)表達(dá)(+)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。由病理科醫(yī)生在雙盲條件下完成。(2)提取組織蛋白及Western blot檢測(cè)FLC蛋白表達(dá)量：往研體中加入液氮，放入組織標(biāo)本，充分研磨組織，加入RIPA裂解液，混均，10 000轉(zhuǎn)、4 ℃條件下，離心30 min，取上清液，得到組織蛋白。Western blot試驗(yàn)步驟：用生物光譜儀測(cè)定蛋白濃度，蛋白上樣量為15 μg，用12%SDS-PAGE凝膠跑膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，加入山羊抗人一抗FLC(1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加入兔抗山羊二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，條帶掃描拍照后用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，前列腺癌組和前列腺增生組表達(dá)率比較用卡方檢驗(yàn)，根據(jù)年齡、前列腺體積、術(shù)前PSA水平、Gleason評(píng)分、臨床分期等水平不同，將前列腺癌組分層，采用Fisher確切概率法，計(jì)量資料使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FLC在前列腺癌與前列腺增生組織中的表達(dá)情況 FLC蛋白染色主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。在前列腺癌中，F(xiàn)LC的過(guò)表達(dá)率為63.3%(19/30)；在前列腺增生中，F(xiàn)LC的過(guò)表達(dá)率為20%(6/30)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 FLC蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)情況(×200)

圖2 FLC蛋白在前列腺增生組織中的表達(dá)情況(×200)

2.2 FLC蛋白與前列腺癌主要臨床指標(biāo)的關(guān)系 在前列腺癌患者年齡分組、前列腺體積分組、術(shù)前PSA分組、Gleason評(píng)分分組、臨床分期分組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 FLC蛋白表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Western blot檢測(cè)FLC蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)前列腺癌組和前列腺增生組FLC蛋白表達(dá)情況,可見(jiàn)前列腺癌組(1.52±0.27)和前列腺增生組(0.41±0.21)相比，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。見(jiàn)圖3。

圖3 前列腺癌(PCa)組和前列腺增生(BPH)組蛋白表達(dá)情況

3 討 論

筆者課題組通過(guò)前期準(zhǔn)備工作發(fā)現(xiàn)在前列腺癌與前列腺增生之間存在一些差異蛋白，篩選出其中研究較少或未曾研究的差異蛋白。由于蛋白組學(xué)和基因組學(xué)其本身的缺點(diǎn)及限制性，需要采用實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行深入研究及驗(yàn)證。

目前發(fā)現(xiàn)鐵蛋白水平的升高與惡性腫瘤等疾病密切相關(guān)，并且人們已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[1]。在常染色體顯性遺傳病遺傳性高鐵蛋白血癥—白內(nèi)障綜合征中發(fā)現(xiàn)鐵蛋白含量增加并對(duì)鐵蛋白的作用機(jī)制進(jìn)行了探討[2]。在關(guān)于黑色素瘤研究的文獻(xiàn)中報(bào)道了鐵蛋白的表達(dá)水平在黑色素瘤中是明顯升高的，鐵蛋白水平的高低與黑色素瘤的惡性程度密切相關(guān)，并在黑色素瘤的發(fā)展過(guò)程中起重要作用[3]。經(jīng)過(guò)近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白重鏈與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，作為與重鏈結(jié)構(gòu)類似的鐵蛋白輕鏈?zhǔn)欠褚矃⑴c腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，引起了人們的興趣，并進(jìn)行了一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究與文獻(xiàn)報(bào)道。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在高級(jí)別骨肉瘤中，腫瘤的惡性程度越高，F(xiàn)LC蛋白的表達(dá)量越高，則預(yù)后較差[4]。已知在人類黑色素瘤中FLC蛋白水平是升高的，發(fā)現(xiàn)如果使FLC蛋白表達(dá)含量降低，則黑色素腫瘤患者的病情得到緩解，生存期延長(zhǎng)[5]。同時(shí)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了FLC蛋白的含量在甲狀腺癌中是升高的，且FLC蛋白在卵巢癌中的表達(dá)也是升高的，可作為診斷卵巢癌的生物標(biāo)志物[6-7]。目前對(duì)于FLC蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究較多，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，乳腺癌組患者的FLC蛋白表達(dá)量升高[8]。隨著乳腺癌惡性程度的逐漸增加，鐵蛋白重鏈和鐵蛋白輕鏈的含量也逐漸增加，鐵蛋白含量的改變可以影響乳腺癌的發(fā)展過(guò)程[9]。總之，F(xiàn)LC蛋白水平在乳腺癌中明顯升高，并進(jìn)一步研究了FLC蛋白在乳腺癌中的細(xì)胞定位及在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，推論出FLC蛋白對(duì)乳腺癌預(yù)后判斷有一定指導(dǎo)價(jià)值[10]。并且已有研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)FLC蛋白對(duì)乳腺癌進(jìn)行診斷及預(yù)后進(jìn)行判定，為乳腺癌的治療提供了一個(gè)新的分子靶向，對(duì)于提高乳腺癌患者的生存期及對(duì)有效緩解病情的發(fā)展有重要意義[11]。筆者課題組為了探討FLC蛋白與前列腺癌之間的關(guān)系，采用免疫組織化學(xué)及Western blot實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)FLC蛋白在前列腺癌組中表達(dá)量升高。這些初步研究結(jié)果為以后將要進(jìn)行的細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，F(xiàn)LC蛋白在前列腺癌中表達(dá)量增加，對(duì)前列腺癌的發(fā)展起重要作用。檢測(cè)FLC蛋白對(duì)鑒別前列腺癌與前列腺增生有一定的幫助，并且能夠?qū)η傲邢侔┑膼盒猿潭冗M(jìn)行初步判斷，可以作為已有前列腺癌診斷手段的有益補(bǔ)充。

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Expression and significance of Ferritin Light Chain in prostate cancer

ChenNing1,ChenChen1,LiZhiguo2,CaoFenghong1.

1DepartmentofUrology,theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China. 2.CentralLaboratoryofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China.

Objective To study the expression and clinical significance of FTL in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. Methods Immunohistochemical method was used to detect the pathological changes of the patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia; protein quantification was performed on specimens collected from patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia by Western blot. Results The expression rates of FTL protein in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia were 63.3% and 20%, respectively, and there were statistical significantly differences(P<0.05). But there were no statistical significantly differences of the FTL protein in the different groups of age, PSA, prostate volume, Gleason score, clinical stage and lymph node metastasis(P>0.05). There were statistical significantly differences of the expression level of FTL protein in the groups of distant metastases(P<0.05). The expression level of FTL protein in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia were (1.52±0.27) and (0.41±0.21), respectively, and there were statistical significantly differences(P<0.05).Conclusion FTL protein is highly expressed in prostate cancer, which can be used as a new diagnostic tool for prostate cancer. FTL protein plays an important role in the development of prostate cancer.

Ferritin Light Chain； Prostate cancer； Hyperplasia of prostate Immunohistochemistry； Western blot

R691.9

A

1000-744X(2016)06-0569-03

2016-03-25)

△通信作者，E-mail：cfh@163.com