miR-675調控低氧誘導肺動脈平滑肌細胞的增殖

王貝諾 劉雪萍 張君國 賀斌峰

·論著·

miR-675調控低氧誘導肺動脈平滑肌細胞的增殖

王貝諾1劉雪萍2張君國3賀斌峰1

目的探討miR-675對低氧誘導大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖的調控作用及相關機制。方法低氧(1% O2)處理PASMCs 48 h，利用Real time-PCR檢測0、6、12、24和48 h時各個時相點miR-675的表達水平，應用Western blot檢測低氧處理PASMCs 48 h 后靶基因REPS2蛋白的表達情況。先合成miR-675抑制劑(inhibitor)再將其和陰性對照(NC)轉染PASMCs細胞，24 h后再進行低氧處理從0h至48 h，應用MTT法檢測0、12、24、48 h時細胞的活力，并檢測REPS2蛋白的表達狀況。構建野生型和突變型REPS2 3′UTR 插入pMIR-REPORTTMluciferase vector載體，并將其與pRL-TK質粒共轉染PASMCs細胞，之后將miR-675 inhibitor和NC分別轉染PASMCs細胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測活性。在常氧下先分別轉染miR-675 inhibitor或模擬物(minic)48 h，再檢測PASMCs中REPS2的表達水平。結果隨著低氧處理時間的延長，miR-675 在PASMCs細胞中的表達水平逐漸增高(P<0.05)。而與對照組比較，REPS2蛋白在低氧處理的PASMCs細胞中表達顯著下調(P<0.05)。miR-675 inhibitor組在24 h和48 h的細胞活力顯著低于對照組和miR-NC組(P<0.01)。熒光素酶報告基因結果說明REPS2是miR-675的靶基因。在常氧環境上調miR-675可顯著下調REPS2蛋白表達，而在常氧和低氧環境下抑制miR-675的水平可明顯升高REPS2蛋白表達。結論miR-675通過下游靶基因REPS2調控低氧誘導的PASMCs的異常增殖，可能是低氧肺動脈高壓、肺源性心臟病等疾病治療的潛在靶點。

miR-675； 低氧； 肺動脈平滑肌； 肺血管重構； REPS2； 增殖

低氧肺血管重構(hypoxia pulmonary vascular remodeling, HPR)及肺動脈高壓是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)發展為肺源性心臟病和呼吸衰竭的關鍵病理學基礎[1]。在我國COPD、慢性肺源性心臟病、高原肺水腫、高原心臟病等多種與肺血管重構關系密切的重要疾病已成為社會的主要負擔和臨床診治的難點。目前認為肺血管重構的主要特征之一是在各種刺激因素下(包括低氧)肺動脈平滑肌異常增生導致的血管結構重塑[2]。因此，探索阻止和逆轉肺動脈平滑肌細胞的異常增殖依然是防治肺血管重構的重點。

普遍存在于各種細胞內的microRNAs (miRNA)是一種非編碼RNA，一般長度僅有18-25bp。研究表明miRNA或miRNA與其他非編碼RNA協同參與了各種生理、病理生命現象的調控，其主要的調控機制是通過與靶基因mRNA的3′UTR完全/不完全互補結合，起到抑制mRNA的翻譯或介導mRNA的降解，從而抑制靶蛋白的表達及其功能[3]。最近的miRNA的研究表明，miRNA在低氧誘導肺動脈高壓、慢阻肺中發揮著重要的作用[4-5]。既往研究表明，miR-675在低肌力和低非脂肪量指數(Fat-free mass idex, FFMI) 的COPD患者血漿中呈高表達[6]，而低肌力和低FFMI意味著高死亡率[7]，提示miR-675的高表達與COPD患者預后較差關系密切。其他研究還表明，上調miR-675可促進多種腫瘤的增殖、轉移和侵襲[8-10]。但目前miR-675在低氧肺血管重構中的表達及其作用尚不清楚。本研究主要檢測miR-675在低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞中的表達，并探索其在增殖中的作用及其可能的機制，為低氧肺血管重構、慢阻肺及肺心病的治療提供新的靶點。

材料與方法

一、主要材料

DMEM培養基GIBCO公司，胎牛血清購自PAN公司，TRIzol regent 購自sigma公司，lipofectamine 2000購自Invirogen公司；陰性對照(Negative control, NC)、miR-675 minic和miR-675 inhibitor均購自上海生工；逆轉錄試劑盒、T4連接酶、HindⅢ和Spe I限制性內切酶購自Fermentas 公司；實時定量試劑盒購自Roche公司；REPS2抗體購自abcam公司，蛋白裂解液和GAPDH單克隆抗體購自上海夢至生物科技有限公司；CKK-8試劑盒購自江蘇碧云天；pMIR-REPORTTMluciferase和pRL-TK 質粒載體購自clonetech生物技術公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自peromega公司。

二、研究方法

1. 大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)的培養： PASMCs細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

2. PASMCs的低氧處理：將PASMCs原有培養基棄去，加入1%胎牛血清的DMEM培養基中培養12 h進行同步化，然后棄去培養基加入10%胎牛血清的DMEM培養基，將細胞放入低氧培養箱中以1% O2下進行低氧處理。

3. miR-675表達的檢測： 按照TRIzol Regent說明書提取細胞的總RNA。應用頸環法檢測miR-675的表達。miR-675的特異逆轉錄引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG

ACTGAGCG-3′，內參U6的逆轉錄引物為5′-CAAAATATGGAACGCTTC-3′，逆轉錄條件為42 ℃ 60 min，72 ℃ 5 min。 逆轉錄獲得的cDNA進行實時熒光定量PCR檢測miR-675的表達，以U6作為內參，序列見表1。每個待測基因設2個復孔。數據通過BIO-RAD CFX96系統進行處理，按照公式RQ=2-△△CT計算各組間的關系。

表1 基因引物序列

4. miR-675 模擬物(minic)、miR-675抑制物(inhibitor)及NC轉染PASMCs ： 將miR-675 minic、miR-675 inhibitor及NC干粉用125 μl RNase-free H2O 配制成20μmol/L的儲存液。miR-675 minic轉染PASMCs細胞的步驟如下：① 將PASMCs消化后，在24孔板中接種約2×105個/孔的細胞；②過夜培養后，棄去培養基，每孔加入40 μl的opti-MEM培養基；③將2.5 μl濃度為20μM 的miR-675 minic加入到47.5l opti-MEM中，輕輕混勻，室溫孵育5 min，將另外一支裝有48μl opti-MEM中EP管中加入2 μl轉染試劑lipofectamine 2000，輕輕吹打混勻，室溫孵育5 min；④將lipofectamine 2000吸入裝有miR-675 minic的EP管中，輕輕混勻，室溫孵育20 min；⑤將100μl混合試劑加入24孔板中，充分混勻；⑥細胞培養48 h后進行PCR和Western blot等檢測。miR-675 inhibitor及NC的轉染同miR-675 minic轉染步驟。

5. MTT檢測細胞增殖：取對數生長期的PASMCs細胞消化后制成細胞懸液，將細胞濃度調整到1×104/孔，接種于96孔板。過夜培養后進行低氧或轉染處理，處理完成后繼續培養48 h后換液，每孔加入10 μl(5 mg/ml)的MTT溶液。37 ℃孵育4 h后，每孔加入150 μl Formanzan溶液，繼續孵育15 min可觀察到Formanzan全部溶解。用酶標儀在570 nm處檢測各孔吸光度(OD值)，空白孔調零。

6. 熒光素酶報告基因檢測：構建野生型和突變型REPS2 3′UTR pMIR-REPORTTMluciferase vector載體；并將上述載體分別與pRL-TK質粒共轉染PASMCs細胞。培養24 h后分別將等量的miR-675 minic和NC轉染PASMCs；轉染48 h后，檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

7. Western blot檢測REPS2蛋白的表達：在培養皿中加入200 μl蛋白裂解液，置于冰上裂解10 min，然后將其收集，于4 ℃、以離心半徑8 cm、12 000 r/min離心20 min，取上清液。蛋白變性后進行SDS-PAGE電泳。蛋白轉印后，將PVDF膜室溫封閉1 h，然后將膜放入含有REPS2抗體 (1︰1 000)及GAPDH抗體(1︰20 000)的抗體稀釋液中，4 ℃過夜。TBST洗3次后孵育二抗，用ECL化學發光法檢測REPS2和GAPDH蛋白的表達水平， GAPDH作為內參來校正各自目的蛋白。

三、統計學方法

結 果

一、低氧干預PASMCs后miR-675的表達水平

利用qPCR檢測了miR-675在低氧處理后PASMCs 中的表達。發現在低氧處理PASMCs的6、12、24和48 h時相點miR-675的表達分別是0 h的1.21±0.03、1.81±0.11、2.59±0.14和3.13±0.07倍(P<0.05)，miR-675在低氧處理后PASMCs 中表達呈時間依賴性，見圖1。

圖1 qPCR檢測miR-675在低氧處理的PASMCs細胞中的表達；注：*與0 h，P<0.05；**與0 h，P<0.05

二、轉染miR-675 inhibitor對 低氧處理下PASMCs細胞活力的影響

分別將miR-675 inhibitor和NC 轉染PASMCs細胞24 h后，將細胞置于1% O2的低氧環境下處理48 h，利用qPCR檢測PASMCs細胞中的miR-675表達水平，發現miR-675 inhibitor和NC組中miR-675的相對表達量分別是對照組的(50.00±6.01)%和(99.67±2.00)%，miR-675 inhibitor組中miR-675的表達顯著低于NC組和單純低氧組(P<0.05) ，見圖2A。我們發現低氧處理24 h、48 h后，Hypoxia組、Hypoxia+NC組和Hypoxia+miR-675 inhibitor組細活力均顯著高于低氧處理0 h和12 h這三組的細胞活力(P<0.05) ，并且在低氧處理24 h、48 h時Hypoxia+miR-675 inhibitor組細胞活力顯著低于Hypoxia組和Hypoxia+NC組(P<0.05)。在各個時相點Hypoxia組和Hypoxia+NC組細胞活力無顯著差異(P<0.05)，見圖2B。上述研究說明下調miR-675的表達可顯著抑制低氧誘導PASMCs異常增殖。

圖2 下調miR-675對PASMCs細胞活力的影響；注：A：qPCR檢測PASMCs轉染miR-675 inhibitor和NC后的miR-675的表達；*與Hypoxia組比較，P<0.01；^與Hypoxia+NC組比較，P<0.01；B：MTT檢測PASMCs細胞轉染miR-675 inhibitor和NC后，其對低氧誘導PASMCs的細胞活力影響。*與0 h比較，P<0.01；^與12 h組比較，P<0.01；#與Hypoxia組比較，P<0.01；&與Hypoxia+NC組比較，P<0.01

三、REPS2是miR-675作用的下游直接靶點

通過生物信息學分析，認為REPS2可能是為miR-675的靶基因。分別構建REPS2野生型和突變型3′UTR質粒熒光素酶報告載體，見圖3A。上述載體與pRL-TK質粒、miR-675 minic或NC一起共轉染PASMCs細胞，然后檢測熒光素酶活性。結果顯示野生型REPS2 3′UTR質粒和miR-675 minic共轉染組的熒光素酶活性低于野生型REPS2 3′UTR質粒和NC共轉染組(P<0.01)。miR-675 minic和突變型REPS2 3′UTR質粒共轉染組與突變型REPS2 3′UTR質粒和NC共轉染組相比較，兩組熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)。上述研究結果證實REPS2是miR-675的作用靶點，見圖3B。此外，我們還發現miR-675 minic轉染PASMCs細胞后，其REPS2蛋白的表達較NC組可顯著降低(P<0.05)，見圖3C。而用miR-675 inhibitor抑制PASMCs中miR-675的表達，REPS2蛋白的表達水平較NC組明顯升高(P<0.05)，見圖3D。進一步說明REPS2是miR-675的直接靶點。

圖3 REPS2是miR-675的靶點；注：A：miR-675與野生型和突變型REPS2 3′UTR端的示意圖；B：熒光素酶報告基因檢測miR-675與REPS2 3′UTR端的結合情況；*與野生型REPS2 3′UTR質粒和miR-675 minic共轉染組，P<0.01；C和D：轉染miR-675 minic/miR-675 inhibitor與NC 48 h后，western blot檢測PASMCs細胞中REPS2蛋白的表達情況

四、下調miR-675促進低氧處理PASMCs中REPS2的表達

前面的研究發現低氧處理后PASMCs中miR-675的表達顯著升高，但其靶點REPS2的表達并不清楚。因此，我們檢測低氧處理PASMCs 48 h后REPS2蛋白的表達情況，見圖4A。發現低氧處理后REPS2較常氧組顯著下調。轉染miR-675 inhibitor、NC后繼續低氧處理48 h后，見圖4B。檢測發現miR-675 inhibitor組和NC組REPS2的表達顯著高于低氧處理組，并且REPS2蛋白在miR-675 inhibitor組的表達明顯高于NC組。

圖4 下調miR-675促進低氧處理PASMCs中REPS2的表達；注：A：REPS2蛋白在低氧和常氧下PASMCs中的表達；B：轉染miR-675 inhibitor和NC后，PASMCs繼續低氧處理后REPS2蛋白的表達水平

討 論

本研究發現miR-675在PASMCs中隨低氧處理時間的延長而表達逐漸升高。利用miR-675 inhibitor可有效抑制低氧誘導的PASMCs異常增殖。此外，還發現增殖相關負性調節因子REPS2是miR-675的直接靶點。因此，我們推測miR-675通過調控REPS2，進而發揮調控PASMCs增殖的作用。

最近研究的表明，miRNA的紊亂在低氧肺血管重構的發生和發展中發揮著重要作用[11]。血清中循環的miRNA，如miR-20, miR-28-3p, miR-34c-5p and miR-100 and miR-7可作為評估、監測COPD進展的生物標志物[12]。Courboulin 等[13-15]指出miR-204在肺動脈平滑肌中的異常上調激活NFAT，下調BMPR2，促進IL-6的生產，導致肺動脈平滑肌細胞的異常增殖和凋亡的抵抗。同樣，miR-21在低氧暴露的人PASMCs中也顯著升高[16]，其可能通過下調PDCD4、SPRY2和PPARα，進而發揮促進PASMCs增殖、抵抗凋亡的作用[17]。本實驗發現，低氧上調PASMCs細胞中miR-675的表達。本研究應用miR-675 inhibitor下調PASMCs細胞中miR-675的表達，結果顯示下調miR-675能抑制低氧誘導的PASMCs的增殖。此外，其他研究表明下調miR-675也可抑制肝癌、食管癌的增殖[18-19]，但具體的作用機制尚不清楚。

本研究在PASMCs中驗證了REPS2 (RALBP1 associated Eps domain containing 2)是miR-675的靶基因。REPS2也被叫做POB1,其可編碼蛋白復合物的一部分，從而發揮調節生長因子內吞的作用。進一步研究發現REPS2通過作用于小G蛋白Ral的GTPase活性蛋白，進而負性調節生長因子受體的內化和抑制生長因子相關信號通路[20]。最近的研究發現REPS2在前列腺癌中的表達顯著降低，并且其可作為評估乳腺癌和前列腺癌進展的潛在分子標志物[21]。本研究發現REPS2是miR-675的靶點，并且調節miR-675的表達可影響REPS2蛋白的表達[19]。本研究還發現低氧下REPS2顯著下調，而此時PASMCs細胞由于處于合成期，增殖能力顯著升高[22]。在PASMCs處于低氧情況下時，miR-675表達受到抑制可上調REPS2的表達，并且下調的miR-675可抑制低氧誘導的PASMCs異常增殖。上述研究提示miR-675通過REPS2進而調控 PASMCs的增殖。但是REPS2調控細胞增殖的具體機制仍不清楚。Tomassi 等[23]的研究指出REPS2蛋白含有中心脯氨酸富集域(central proline rich domain)，其負性調節激活的EGFR受體的內化過程，進而影響細胞的增殖。因此，我們推測在PASMCs中REPS2也可能通過上述機制調控細胞的增殖。

本研究尚存在一些不足：①研究在體外證實了miR-675通過REPS2調控PASMCs細胞增殖，但在體內miR-675是否依然具有抑制PASMCs增殖和阻止低氧肺血管重構的作用尚不清楚；②盡管我們發現REPS2可以調控低氧誘導的PASMCs的增殖，但是具體機制依然不明確。

綜上所述，下調miR-675通過促進靶基因REPS2的表達，進而發揮抑制低氧誘導的PASMCs細胞異常增殖的作用。上述研究提示miR-675可成為治療低氧肺動脈高壓、慢阻肺、肺心病的潛在靶點。

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(本文編輯：王亞南)

王貝諾，劉雪萍，張君國，等. miR-675調控低氧誘導肺動脈平滑肌細胞的增殖[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(6)： 625-630.

miR-675 modulates hypoxia-induced proliferation of pulmonary artery smooth muscle cell by targeting REPS2

WangBeinuo1,LiuXueping2,ZhangJunguo3,HeBinfeng1.

1DepartmentofRespiratoryDiseases,theSecondAffiliatedHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,PRChina.2DepartmentofThoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,PRChina;3EmergencyDepartment,Fengducountypeople′shospital,Chongqing400037,PRChina

HeBinfeng,Email:ldhbf@tmmu.edu.cn

Objective To explore the mechanism and effect of miR-675 regulation hypoxia induced proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs). Method The relative expression of miR-675 have been detected by real time-PCR while PASMCs were under 1% O2hypoxia for 0, 6, 12, 24 and 48 h. The protein expression of REPS2 was measured by western blot when PASMC have been exposed at hypoxia for 48 h. The sequence of miR-675 inhibitor and NC were synthesized. They were transfected into PASMCs for 24 h, and then PASMCs were treated by hypoxia for 48 h. The cell viability and REPS2 protein levels of PASMCs was evaluated at 12, 24 and 48 h by MTT and western blot. The wild-type and mutation of REPS2 3′UTR was inserted into the plasmid of pMIR-REPORTTMluciferase vector, which was co-transfected into PASMCs with pRL-TK plasmid. miR-675 minic and NC was transfected into these cells, which had been transfected pMIR-REPORTTMluciferase vector and pRL-TK plasmid. Firefly and Renilla reniformis luciferase activities were measured 48 h later. Additional, the protein expression of REPS2 was detected when PASMCs was treated with miR-675 inhibitor or minic for 48 h. Result The miR-675 levels was time-depended manner while PASMCs were under hypoxia exposed (P<0.05). The expression of REPS2 protein was significant lower in hypoxia group, compared to normoxia group (P<0.05). The cell viability of PASMCs were makeable decreased under hypoxia 24 and 48 h after PASMCs had been transfected miR-675 inhibitor, compared to NC group(P<0.01). Luciferase assay showed REPS2 was a direct target gene of miR-675. Up-regulation of miR-675 was significant decreased the expression of REPS2 while miR-675 minic was transfected into PASMCs in normoxia. On the contrary, down-regulation miR-675 by miR-675 inhibitor was remarkable elevated REPS2 protein level both normoxia and hypoxia. Conclusion miR-675 regulated the hypoxia induced PASMCs proliferation by target gene REPS2, and it maybe consider as a novel treatment target for hypoxia PAH and cor pulmonary.

miR-675; Hypoxia; Pulmonary vascular remodeling; REPS2; Proliferation

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.06.010

國家自然科學基金面上項目(81670047)

400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院呼吸內科1、胸外科2408200 重慶市豐都縣人民醫院急診科3

賀斌峰，Email: ldhbf@tmmu.edu.cn

R563

A

2016-11-02)