重視循環腫瘤細胞分子檢測在非小細胞肺癌的臨床應用

曾瑄 梁智勇

·專家論壇·

重視循環腫瘤細胞分子檢測在非小細胞肺癌的臨床應用

Pay attention to clinical application of circulating tumor cells test in non small cell lung cancer

曾瑄 梁智勇

梁智勇，主任醫師，教授，博士生導師,北京協和醫院病理科主任。現任中華醫學會病理學分會侯任主任委員，中國醫師學會病理科醫師分會副會長，中國醫療保健國際交流促進會理事/病理專業委員會常務副主任委員，中國研究型醫院學會病理專業委員會副主任委員，中華醫學會病理學分會、中國抗癌協會腫瘤病理專業委員會及國家衛生計生委病理質控中心分子病理組組長，北京醫學會病理學分會副主任委員，《診斷病理學雜志》總編，《中華病理學雜志》、《臨床與實驗病理學雜志》、《Endocrine Pathology》、《Chronic Diseases》and《Translational Medicine》編委。

非小細胞肺癌； 循環腫瘤細胞； 分子檢測

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)是在惡性腫瘤患者血液中發現的一種源于腫瘤的上皮細胞。一般來說，CTCs極其罕見，與白細胞的比率大約為1︰106-107。所以CTCs富集技術的突破是該研究得以深入進行的必要前提。美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)曾先后批準了基于上皮標記(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)的CTCs獲取并計數的技術平臺(cellsearch)用于乳腺癌、結直腸癌及前列腺癌的預后評估。2015年中國食品和藥物管理局(China Food and Drug Administration, CFDA)批準了上皮源性的CTC檢測試劑盒用于轉移性乳腺癌的監測。

近來，相關研究顯示CTCs也可在非小細胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)的診斷、生物學特性的確認和疾病監測中發揮重要的作用，而隨著技術的發展，CTCs分子特征的檢測更突顯出其獨特的臨床價值。比如，在某些特定的情況下，由于組織或細胞病理學材料無法獲取，并且在疾病進程中難以實現多次活檢，為及時了解腫瘤生物學特征的變化而適時采取有效治療措施，CTCs檢測可提供很好的幫助。

CTCs的富集主要包括基于物理的和生物的兩類方法，前者包括膜過濾(如ISET)、芯片過濾(如Cluster Chip)、密度梯度離心(如Ficoll.Paque)、聲動力(如Acoustophoresis Chip)及電泳(如DEPArray)等；后者主要包括正向(選擇CTCs，如cellsearch)和負向(選擇白細胞, 如CTC.iChip)免疫富集法等[1]。

起初，CTCs的檢測方法，主要是針對核酸和蛋白特征，例如通過逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcript polymearse chain reaction, RT-PCR)檢測腫瘤細胞mRNA的差異表達來推斷CTCs的存在；而定量PCR的使用, 與普通PCR相比, 又進一步提高了靈敏度和特異性。但此類技術因缺乏形態學及數目等重要信息，而被新技術取代，以計數為主要目標的CTC技術則成為主流。隨后，在此基礎上不斷迭代更新，衍生出諸多更優化的平臺。目前應用最多的是基于上皮細胞標記(生物法)和上皮細胞大小(物理法)而分離肺癌CTCs 的方法，例如cellsearch和ISET等。前者結合了免疫磁珠標記和自動數字顯微鏡技術，先以納米磁珠包被的抗EpCAM的抗體富集上皮細胞，然后分別以熒光標記的抗CK和CD45的抗體檢測富集的標本，再行自動顯微成像計數分析；后者是一種基于細胞大小的微膜過濾技術，因為大多數腫瘤細胞直徑大于(>8 μm)白細胞, 富集的細胞可以于微膜上進行染色及進一步分析。它既可獲取單個CTCs，也可獲取循環腫瘤微栓(circulating tumor microemboli, CTM)，而且規避了cellcearch技術的假陽性(EpCAM表達的非腫瘤細胞)和假陰性(上皮間質轉化時EpCAM高表達缺失)；但該方法仍有小的CTCs可能被漏檢，而大的白細胞可能被截留等不足。

鑒于上述工作的積累，涌現出了更多的CTCs技術平臺，例如除了考慮混合間質標記(如OncoCEE)外，還結合相關生物標記(如liquid biopsy)以及物理方法(如GEDI)等。這些方法在提高CTCs的富集效率和完善體系等方面，做了有意義且較成功地探索。

近來，一種體內捕獲CTCs的技術(GILUPI CellCollector，DiagnostikNet, German)在肺癌研究中得以有效地嘗試，它是通過肘靜脈留針(30 min)的方式獲取與附著抗體結合的上皮細胞。因不受采血量的限制，規避了肺癌可能因上皮間質轉化(epithelial to mesenchimal transition, EMT)高發所帶來的上皮標記陽性細胞減少而難于獲取目標CTCs的問題；但若要對獲取器上的CTCs進行形態學染色分析，則將是面臨的一個新的挑戰。CTC的技術發展很快，新技術不斷涌現并彌補了原有方法的各種不足，但最終目的是力求在改進和創新中逐步完善。當下，各種平臺互補是大多數學者最多采用的策略[2]。

近年來, 隨著分子檢測技術的發展, 以及患者全程精細化管理的需求, 國內液體活檢技術也有了突破性進展, 以血液游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)為代表的液體活檢(liquid biopsy)技術, 已陸續獲批CFDA而用于臨床常規, 成為組織或細胞標本不足以滿足分子標記，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變，檢測需求時的補充材料，并先后于2015年和2016寫入肺癌的相關診療指南中[3-4]。隨后，中國學者采用納米基質包被抗體的技術(Nano Velcro)，顯著提高了肺癌CTCs的捕獲效率[5]。與以往相比，在液體活檢的探索中，國內的發展呈現出更快更強的勢頭。

目前，絕大多數常規分子標記檢測技術均可以在CTCs上有效地實施，如PCR, FISH及IHC等，這一點十分重要。肺癌的分子分型是制定有效的個體化治療方案的重要參考依據。譬如EGFR基因敏感突變(如19外顯子缺失或21外顯子L858R)的患者，是EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)，如(易瑞沙(gefitinib)、凱美納(conmana)、特羅凱(tarceve)及阿法替尼(afatinib)等獲益的候選人群；淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)或ROS1基因重排的患者，治療則首選ALK抑制劑，如克唑替尼(crizotinib)；而PD-L1表達陽性的患者對免疫檢查點抑制劑(如派姆單抗Keytruda)顯示出具有很好的療效[6]。CTCs分子特征的檢測，尤其針對治療過程中(實時組織活檢很難實現)及時發現耐藥并適時調整后續治療方案(T790M 將受益于靶向藥AZD9291)，具有重要的意義。

Maheswaran等[7]以ARMS法同時檢測了27例NSCLC的CTCs和cfDNA標本，并以原發灶組織活檢作為對照，檢出EGFR基因突變率分別為92%和33%。Ran等[8]以負向富集法獲取了37例NSCLC患者的CTCs后，采用激光顯微切割分離出單個CTCs并進行全基因組擴增，繼而以PCR測序檢出EGFR基因19外顯子缺失、L858R和T790M分別為85%、55%和45%。Marchetti等[9]以cellSearch獲取CTCs后，以NGS檢出EGFR基因突變率為84%，與組織學結果一致。Pailler等[10]采用上皮和間質雙標記富集CTCs后，以FISH法檢測了ALK重排，全部18例組織標本ALK陽性的患者中，均檢出數量不等的CTCs，并且具有ALK重排特征，其中包括上皮標記陰性的CTCs(EMT)，而且CTCs之間存在異質性(分別具有3’/5’分離或僅有3’信號的特征)；Pailler等[11]針對4例組織學ROS1陽性的NSCLC患者，以ISET法均檢出了CTCs，且以FISH法確認均為ROS1陽性，與組織學結果一致，而且發現CTCs之間存在遺傳異質性(ROS1基因拷貝數不同)。

與已知的其它幾種較易發現CTCs的腫瘤相比，肺癌可能有更高的EMT機率，憑借傳統的基于上皮標記的富集技術往往難以得到可靠穩定的CTCs數據，而且也不能準確反映腫瘤的變化特征；而若采用一組上皮與間質混合抗體進行CTCs捕獲，雖然一定程度上克服了上述不足，但仍存在尚待一些解決的問題。Schehr JL等，采用含有上皮和間質標記(EpCAM, MUC1或Vimentin)的組合抗體富集NSCLC的CTCs，發現幾種常用抗體對CTCs均有不同程度的誤識別(例如 CD11b+骨髓細胞)，而CD45表達缺失的中性粒細胞和不成熟的骨髓細胞也會有一定程度的PD-L表達，這將影響PD-L1表達陽性CTCs的準確檢出[12]。

與僅辨別有否CTCs或其數量的變化相比，CTCs的分子特征檢測具有更重要的臨床意義，它除了可以揭示腫瘤進展過程中分子變化規律，為尋求針對性地治療措施提供理論依據外，也是深入了解耐藥的分子基礎及腫瘤異質性特征的最佳材料，可為研發特異性的靶向藥或相關治療手段提供重要信息。另外，尚存在大多數CTCs檢測技術操作環節多，分析過程復雜，易受人為因素影響等有待改進之處。期待隨著研發技術的更新與突破、研究數據的大量積累，具有高效富集、自動化程度高、性能穩定、識別準確、可操作性強的CTCs系統，在不遠的未來應用于臨床。

1 Ferreira MM, Ramani VC, Jeffrey SS. Circulating tumor cell technologies [J]. Mol Oncol, 2016, 10(3): 374-394.

2 Hofman V, Ilie MI, Long E, et al. Detection of circulating tumor cell as a prognostic factor in patients undergoing radical surgery for non small cell lung carcinoma: comparison of the efficacy of the CellSearch AssayTM and the isolation by size of epithelial tumor cell method[J]. Int J Cancer, 2011, 129(7): 1651-1660.

3 《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制訂專家組. 非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識[J]. 中華醫學雜志, 2015, 95(46): 3721-3726.

4 中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家組.中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識(2016版)[J]. 中華病理學雜志, 2016, 45(4): 217-220.

5 Lin M, Chen JF, Lu YT, Nanostructure Embedded Microchips for Detection, Isolation, and characterization of circulating tumor cells[J]. Acc Chem Res, 2014, 47(10): 2941-2950.

6 Herbst RS, Baas P, Kim DW, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial[J]. Lancet, 2016, 387(10027): 1540-1550.

7 Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S, et al. Detection of mutation in EGFR in circulating lung-cancer cells[J]. N Engl J Med, 2008, 359(4): 366-377.

8 Ran R, Li L, Wang M, et al. Determination of EGFR mutations in single cells microdissected from enriched lung tumor cells in peripheral blood[J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405(23): 7377-7382.

9 Marchetti A, Del Grammastro M, Felicioni L, et al. Assessment of EGFR mutations in circulating tumor cell preparations from NSCLC patients by next generation sequencing: toward a real-time liquid biopsy for treatment[J]. PLoS One, 2014, 9(8): e103883.

10 Pailler E, Adam J, Barthélémy A, et al. Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement in ALK-positive non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2013, 31(18): 2273-2281.

11 Pailler E, Auger N, Lindsay CR, et al. High level of chromosomal instability in circulating tumor cells of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer[J]. Ann Oncol, 2015, 26(7): 1408-1415.

12 Schehr JL, Schultz ZD, Warrick JW, et al. High specificity in circulating tumor cell identification is required for accurate evaluation of programmed death-ligand 1[J]. PLoS One, 2016, 11(7): e0159397.

(本文編輯：張大春)

曾瑄，梁智勇. 重視循環腫瘤細胞分子檢測在非小細胞肺癌的臨床應用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(6)： 587-589.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.06.001

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2016-11-23)