提高免疫組化染色質量的經驗總結

阮順愛 蔡愛英 林秀香

（福建莆田市第一醫院病理科，福建 莆田 351100）

提高免疫組化染色質量的經驗總結

阮順愛 蔡愛英 林秀香

（福建莆田市第一醫院病理科，福建 莆田 351100）

目的分析影響免疫組化染色質量的因素，總結提高染色質量。方法在免疫組化染色過程中，嚴格執行操作規范；標本及時充分的固定、組織的正確處理、合適的抗原修復和合理運用緩沖液和稀釋液，保證染色試劑的有效濃度和有效期，合適的烤片溫度和時間，正確的制片方法等。結果保存了組織抗原的免疫活性，極少出現非物異性背景染色和假陽性反應。結論認真對待免疫組化染色過程中的各個環節，避免不良現象發生，可獲得滿意的染色結果。

免疫組化；染色質量；總結

隨著醫學技術的飛速發展，疾病種類的不斷變化，病理醫師和臨床醫師對免疫組化的依賴性日益增加，免疫組化技術已列入日常操作，并廣泛運用于臨床，在病理診斷中起重要作用。但免疫組化在實際操作中受很多因素影響，任何一環節出現差錯，都可能導致結果不準確，而導致診斷失誤。作者通過實踐總結出一些經驗，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料：材料均來源于我科日常工作的常規標本，按規范[1]操作及染色。

1.2 方法

1.2.1 嚴格執行臨床病理操作規范，嚴格遵循中華醫學會編著的《臨床技術操作規范病理學分冊》相關內容，并嚴格按照操作規范操作，采用SP法即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法。

1.2.2 標本的固定：用中性福爾馬林固定液固定標本8～20 h。

1.2.3 組織的包埋、切片、烤片：常規石蠟包埋，切片，切片厚度2～3 μm。切片避免刀痕和組織折疊，并用防脫玻片，烤片溫度60～62 ℃，拷片時間2～3 h。

1.2.4 抗原修復

1.2.4.1 切片常規脫蠟至水，用生理鹽水或蒸餾水沖洗一次，再用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.2 利用自動染色儀幫助監測抗體或試劑的有效成分，并保證試劑在有效期內。

1.2.4.3 滴加一滴3%甲醇雙氧化溶液，室溫下10 min，然后 PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.4 抗原修復：需進行抗原修復的，據需要或將切片置于盛有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋內高壓修復3 min；或用EDTA水浴加熱10 min；或用胰酶或胃酶消化15 min，PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.5 滴加第一抗體：置濕盒中4 ℃過夜，PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.6 滴加第二抗體：置室溫下15 min，PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.7 DAB顯色：滴加新鮮配制DAB溶液，鏡下控制顯色強度。

1.2.4.8 水洗，蘇木素復染，中性樹膠封固。

2 結 果

染色質量標志：陰性和陽性對照標準率均達到標準。

3 討 論

3.1 免疫組化染色的意義：免疫組化在臨床及病理診斷中已廣泛應用，對疾病的判定、鑒別診斷及判定疾病的預后及臨床醫師對疾病的治療具有重要的指導意義。嚴格做好免疫組化質量控制是提高病理診斷水平的重要里程碑。

3.2 嚴格執行臨床病理操作規范：為提高免疫組化染色的準確率，病理工作人員在工作中應嚴格遵循中華醫學會編著的《臨床技術操作病理學分冊》相關內容規定，如免疫組化的適用范圍，不宜應用的范圍等。并嚴格按照操作規范操作，并不斷總結經驗是提高免疫染色質量的先決條件[2]。

3.3 注意事項

3.3.1 組織固定要充分及時且不宜超過24 h，若固定時間過長，由于甲醛及組織蛋白間的交聯等作用致使細胞的抗原決定簇被覆蓋、丟失，影響其表達活性，但組織沒有完全固定，則造成細胞溶解、抗原丟失。

3.3.2 烤片溫度不宜過高（≤62 ℃），溫度過高且時間＞4 h組織長時間暴露在高溫下則可能出現邊緣假象。因此當要顯示低表達抗原時，烤片應該在37 ℃或室溫下干燥過夜。

3.3.3 組織切片不宜過厚或過薄（2～3 μm），并盡量減少刀痕及組織折疊，否則易出現背景過深或特異性染色。

3.3.4 嚴格監控試劑的有效期和有效濃度。

3.3.5 自動化染色可最大程度減少操作程序上的錯誤，而手工染色要嚴格保持操作方法的一致性。

3.3.6 注意監控染色質量：每批染色后都應進行質量檢查并作陰、陽性對照，盡量采用內對照，如用血管壁平滑肌是否著色來判斷Actin著色是否成功。

4 假陰性著色原因

假陰性著色指組織中的抗原應該表達卻沒有著色。

4.1 脫蠟不完全：石蠟層會干擾甚至抑制抗體與抗原結合，需在二甲苯中徹底脫蠟，二甲苯和酒精應定期更換。

4.2 修復液不正確：不是所有抗原修復液溶液都適用于所有抗體，當抗原用EDTA修復最佳時，換用檸檬酸修復液有可能造成假陰性結果。

4.3 抗原熱修復溫度不夠充分：沒達到合適溫度和規定時間，充分逆轉固定可能無法實現。

4.4 酶修復過度：若組織被過度修復致其形態學破壞，則其抗原可能就不再與抗體結合，從而造成假陰性結果。

4.5 抗體濃度：抗體在4 ℃冷藏一段時間后效價會降低，并在某個時候會迅速下降以致產生陰性結果。

4.6 顯色劑不相容：標準組合是HRP酶與DAB顯色劑組合，核快紅顯色劑與BCIP/NBT起反應，只用于堿性磷酸酶。

4.7 步驟錯誤：如沒按正常順序或時間完成，試劑配制錯誤，儀器電腦出故障，試劑標簽貼錯，切片擺放錯誤等。

總之，進行免疫組化染色須有高度的責任心，嚴格執行操作規程，避免不良現象發生，經常做實驗后總結工作，可提高免疫組化染色質量。

[1] 中華醫學會.臨床技術操作規范病理學分冊[M].北京:人民軍醫出版社,2004:10-12.

[2] 2015全國衛生專業技術資格考試指導病理學技術[M].北京:人民衛生出版社,2014:10-101.

R446.6

B

1671-8194（2017）20-0033-02