自制沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸檢測試劑的性能評價

王偉偉周林福鐘 磊*

（1 浙江大學醫學院醫學生物技術研究室，浙江 杭州 310058；2 桐鄉市中醫醫院，浙江 桐鄉 314500）

自制沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸檢測試劑的性能評價

王偉偉1周林福1鐘 磊2*

（1 浙江大學醫學院醫學生物技術研究室，浙江 杭州 310058；2 桐鄉市中醫醫院，浙江 桐鄉 314500）

目的評價自主開發針對嬰幼兒感染的沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體的多重核酸檢測試劑的性能。方法采用熒光定量PCR儀，進行準確度、靈敏度、最低檢測線及穩定性的性能評價，與金標準測序進行對比。結果通過臨床樣本檢測，對比金標準測序法，自主研發的試劑盒操作具有靈敏度高、準確高、特異性強等特點。結論試劑盒的指標基本達到了國內臨床診斷試劑所要求的主要性能指標，可以滿足臨床樣本的診斷，是一種值得推廣的診斷試劑。

沙眼衣原體；肺炎衣原體；肺炎支原體；熒光定量PCR；檢測試劑

肺炎衣原體（chalamydia pneumoniae，C.pn）屬于嚴格的人類病原體，傳染途徑是呼吸道分泌物，擴散較為緩慢，潛伏期長（平均30 d），其感染可引起呼吸系統疾病，如肺炎、咽炎、喉炎、支氣管炎等。肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是一種常見的呼吸道病原體，通常導致輕微的上呼吸道感染，如喉嚨痛、咽喉炎和氣管炎，其引起的肺炎占非細菌性肺炎的50%，還可引起肺外并發癥，其潛伏期較長（2～3周），通過飛沫以氣溶膠形式傳播，存留在鼻、喉、氣管和痰液中，密切接觸可能引起肺炎支原體的暴發。沙眼衣原體（chlamydia trachomatis，CT）引起多種疾病，如沙眼，人類泌尿生殖道疾病，還可以通過母嬰傳播新生兒眼結膜炎、肺炎，并可導致胎膜早破、早產、新生兒死亡等，也是導致嬰兒下呼吸道感染及黃疸的主要原因之一[1-2]。

本研究采用熒光PCR技術檢測沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸，操作簡便、檢測迅速、檢出率高，通過一次試驗即可明確是否屬3種病原體感染及何種病原體感染，有利于疾病的及時診斷及合理選擇治療方案，與傳統分離培養技術及血清學等檢測技術相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率。

1 材料與方法

1.1 儀器：ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.2 試劑：自主研發的沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體檢測試劑盒，采用聚合酶鏈式反應（PCR）結合Taqman熒光探針，對人痰液樣本中沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸進行定性檢測。

1.3 臨床樣本：本研究所采用的兒童痰液樣本由浙江大學醫學院附屬兒童醫院提供；帶狀皰疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、鼻病毒為病毒培養物，由浙江疾病預防控制中心提供；鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎球菌為臨床陽性樣本，由浙江大學醫學院附屬兒童醫院提供；HCV為臨床陽性樣本，由浙江大學醫學院附屬第二醫院提供；HBV為臨床陽性樣本，由浙江大學醫學院附屬第一醫院提供。

1.4 測定方法：采用ABI7500實時熒光定量PCR儀，設置條件為50 ℃、2 min使UNG酶發揮作用；95 ℃、2 min進行預變性；91 ℃、15 s，58 ℃、60 s，共進行40個循環，在58 ℃、60 s階段收集熒光信號。

1.5 靈敏度分析：將Ct值相差2以內的沙眼衣原體陽性樣本、肺炎衣原體陽性樣本和肺炎支原體陽性樣本等體積混勻，采用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，分別稀釋10倍和100倍，將試劑每一梯度進行10次重復檢測。實驗在ABI7500儀器上進行，以分析產品的靈敏度。

1.6 最低檢測限確認：抽提質控品的質粒DNA，Nonadrop儀器測DNA的濃度，換算得到拷貝數，將此DNA進行10倍梯度稀釋后進行擴增，制備標準曲線，通過標準曲線，得到臨床樣本中病毒載量。將各樣本濃度稀釋至500 copies/mL左右，對此濃度的樣本進行10次重復檢測。

1.7 準確度分析：采用與金標準測序的方法來驗證試劑的準確度，選擇沙眼衣原體樣本、肺炎衣原體樣本和肺炎支原體樣本各3例，將本自主研發的試劑和測序進行比對，進行準確度分析。

1.8 特異性分析：本試劑在ABI7500儀上進行試驗，檢測臨床陰性樣本，另檢測具有相同感染部位或相似臨床癥狀的病毒樣本，如皰疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎球菌等。

1.9 精密度分析：將Ct值相差2以內的、較低濃度的沙眼衣原體陽性樣本、肺炎衣原體陽性樣本和肺炎支原體陽性樣本等體積混勻，用該自主研發的試劑對此混合樣本進行10次重復檢測，計算變異系數，以確定批間和批內精密度。

1.10 抗干擾試驗：本試劑在ABI7500熒光定量PCR儀上，對痰液樣本中可能存在的干擾物質進行了驗證試驗。

根據中華醫學會呼吸病學分會發布的《社區獲得性肺炎診斷和治療指南》。目前，對于支原體和衣原體的感染治療，臨床應用較多的藥物是大環內酯類、喹諾酮類和β-內酰胺類，因此，選用阿奇霉素、阿莫西林和羅紅霉素作為可能存在的治療藥物進行驗證，藥物濃度分別為0.15 g/L、0.2 g/L、0.03 g/L。另，選擇樣本中較常見的異常病理成分血和膿液進行驗證試驗，即在樣本中添加10%的血清和5%的膿液進行抗干擾試驗。

1.11 四色熒光相互干擾試驗：本試劑需要采用FAM、VIC、CY5和ROX四種熒光進行實驗。其中，CY5指示內標，FAM熒光指示沙眼衣原體（CT），VIC熒光指示肺炎支原體（MP），ROX熒光指示肺炎衣原體（CP）。為驗證4種熒光之間是否存在相互干擾，采用該試劑在ABI7500熒光定量PCR儀上進行驗證試驗。

2 結 果

2.1 靈敏度分析：本試劑使用ABI7500熒光定量PCR儀進行檢測，當樣本的Ct值＞35左右時，10次重復不能100%檢出陽性。

2.2 最低檢測限確認：將各樣本濃度稀釋至500 copies/mL左右，對此濃度的樣本使用試劑在ABI7500熒光定量PCR儀進行10次重復檢測，檢測結果表明，10次重復能夠100%檢出。

2.3 準確度分析：將選擇的每個病原體陽性樣本3例，使用試劑在ABI7500熒光定量PCR儀進行檢測，然后樣本經過測序所得序列經Blast比對，樣本對應的肺炎衣原體、肺炎支原體還是沙眼衣原體，與試劑檢測結果符合率100%。

2.4 特異性分析：本試劑分別在ABI7500熒光定量PCR儀上進行試驗，檢測50份臨床陰性樣本，陰性符合率是100%，另檢測具有相同感染部位或相似臨床癥狀的病毒樣本，如皰疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎球菌等，檢測結果均是陰性。

2.5 精密度分析：選用三批試劑，對內標、CT、CP和MP分別進行檢測，重復10次，計算平均值、標準差、批內精密度、批間精密度。檢測結果統計得出，批間變異系數在3.25%～7.64%，批內變異系數在0.58%～2.12%，說明了本試劑盒具有良好的批間和批內精密度。

2.6 抗干擾試驗：臨床樣本均為痰液樣本，將不添加任何物質的樣本的原始樣本，分別添加血液、膿液、阿奇霉素、羅紅霉素和阿莫西林[3-4]。計算添加了干擾物的樣本的檢測值與原始樣本的檢測值之間的平均值。從結果可以看出，0.15 g/L的阿奇霉素、0.2 g/L阿莫西林、0.03 g/L羅紅霉素、10%血清和5%膿液對試驗結果均沒有顯著影響。

2.7 四色熒光相互干擾試驗：將Ct值相差2以內的肺炎支原體陽性樣本、肺炎衣原體陽性樣本和沙眼衣原體陽性樣本等體積混合后進行檢測，單一樣本用2倍體積同類型陰性樣本稀釋后檢測。各種不同濃度梯度的樣本混合后進行檢測，與單一樣本檢測之間的CV值在6%以內，表示沒有顯著差異，即各種熒光之間沒有干擾。

3 討 論

自開發的試劑，通過臨床樣本檢測，對產品性能進行評價，自主研發的試劑盒操作具有靈敏度高、準確高、特異性強等優點，達到了國內臨床診斷試劑所要求的主要性能指標，可以滿足臨床樣本的核酸診斷，是一種值得推廣的診斷試劑。

[1] Khan ER,Hossain MA,Paul SK,et al.Molecular diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infection by polymerase chain reaction[J].Mymensingh Med J,2011,20(3):362-365.

[2] Maass V,Kern JM,Poeckl M,et al.Sequence Homologies between Mycoplasma and Chlamydia spp.Lead to False-Positive Results in Chlamydial Cell Cultures Tested for Mycoplasma Contamination with a Commercial PCR Assay[J].J Clin Microbiol,2011,49(10):3681-3682.

[3] Brittain-Long R,Andersson LM,Olofsson S,et al.Seasonal variations of 15 respiratory agents illustrated by the application of a multiplex polymerase chain reaction assay[J].Scand J Infect Dis,2012,44(1):9-17.

[4] Thurman KA,Warner AK,Cowart KC,et al.Detection of Mycoplasma pneumoniae,Chlamydia pneumoniae,and Legionella spp.in clinical specimens using a single-tube multiplex real-time PCR assay[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2011,70(1):1-9.

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1671-8194（2017）20-0031-02

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