全基因組關聯分析在中醫證候研究中的應用展望*

陳 剛，周 欣，薛文達，吳顥昕

(南京中醫藥大學基礎醫學院轉化系統生物學與神經科學研究中心，中醫腦病學重點實驗室，南京 210023)

【綜述】

全基因組關聯分析在中醫證候研究中的應用展望*

陳 剛，周 欣，薛文達，吳顥昕

(南京中醫藥大學基礎醫學院轉化系統生物學與神經科學研究中心，中醫腦病學重點實驗室，南京 210023)

中醫證候的科學本質是中醫基礎研究中的核心內容，也是揭開中醫辨證論治個性化治療奧秘的關鍵，但目前對其的認識仍然有限。通過介紹復雜性狀遺傳學的基本概念，提出將證候作為生命活動表現的復雜性狀，運用復雜性狀遺傳學研究手段，特別是當前迅速發展的全基因組關聯分析(Genome-wide association study，GWAS)方法，以解析證候個體化差異的分子遺傳基礎。除了進行人群的證候GWAS研究，還可利用遺傳參照種群小鼠資源進行證候的分子及系統網絡GWAS研究。故展望了在中醫基礎研究中利用模式動物建構合適的中醫病-證模型進行GWAS研究的廣闊前景，該方法的推廣應用將在新的方向上推動中醫基礎研究的發展。

證候;復雜性狀遺傳學;全基因組關聯分析;遺傳參照種群小鼠;模型

中醫的特色及優勢在于整體觀念和辨證論治，即在系統了解疾病與患者特點的基礎上，通過望聞問切等手段辨識證候段，對證遣方用藥。證候是生命活動的外在表現，體現出疾病病理的時空維度。證候本質的研究是中醫學現代研究的核心，也是最有挑戰性的領域，一定程度上是制約中醫基礎理論學科乃至整個中醫學科現代發展的最主要因素［1］。揭示證候的生物學基礎對確立證候科學內涵與闡明證候科學本質不可或缺。盡管經過多年的研究和探索，目前對證候的特點和機制有了一定的了解，但是由于病證機理復雜，特別是研究思想、方法與手段上的限制，對證候本質的認識仍然不夠深入。

1 中醫證候的特點及其復雜性

一般認為，證候既反映疾病在同一個體上的階段性病理生理變化，具有鮮明的時相性特征;同一階段內在不同人群中又有證候類型之別，反映出空間性特征。證候的差異性來自于遺傳與環境共同作用，是遺傳物質對生命活動生物整體層面的表現。這種表現可以像任何可測量的物理或生物化學特征一樣進行分析，該分析方法通常被稱為“表現型”或“表型”(phenotype)分析。理論上，所有個體間的某表型差異可以通過與基因型的差異性進行聯系，以解析基因型如何參與決定該表型。因此，可以運用現代遺傳學技術，以證候的相關表型為研究對象，鑒別與說明證候的分子遺傳基礎從而揭示其生物學本質。

證候的復雜性決定了其表型分析需要運用復雜性狀遺傳學(complex trait genetics)的方法［2］。在生物界，大多數疾病表型均是復雜性狀，受多種基因(polygenic)及其與環境相互作用的影響，而不是簡單地遵循孟德爾遺傳，即單基因(質量性狀)遺傳。數量眾多但是單個效果比較小的基因，及他們與環境的相互作用常常使表現型呈連續(數量)分布。因此，對此類性狀的研究稱為數量性狀遺傳學或復雜性狀遺傳學［3］。經典的孟德爾遺傳學的觀點認為，1種性狀(trait)是由1種基因控制的，某種基因的缺陷足以導致特定的障礙［4］。但是人體大部分性狀并不遵循孟德爾單基因遺傳規律，如高血壓［5］、青光眼［6］等疾病都表現為復雜性狀。某種特定中醫證候在人群個體間常常在程度或范圍上有所差異，很少是全或者無這種典型的質量性狀表現。由此，大部分中醫證候都應歸于復雜性狀。

2 復雜性狀遺傳學研究方法及其在中醫證候研究中的應用

復雜性狀遺傳學在研究方法上主要有兩類。傳統的復雜性狀遺傳學通過雙生子、收養子家系研究來探索遺傳對特定性狀的貢獻率［7］。幾十年來的研究結果充分說明，遺傳因素影響著幾乎所有的復雜性狀。遺傳變異對許多復雜性狀，如對行為影響的遺傳度估計值大多在0.4～0.6之間［8］，也就是說，表現型變異的40%至60%是由遺傳差異性決定的。已有研究者提出運用雙生子研究中醫證候［9］。通過家系的基因型連鎖研究(linkage studies)方法［10］，可以篩查出影響特定性狀的某個染色體區域，甚至可以精確定位影響該形狀的特定基因。然而大多數復雜性狀往往牽涉很多微效基因，單獨的連鎖研究很難鑒定這些微效基因。現在常通過結合基因組、基因表達、蛋白質相互作用等信息來幫助鑒別特定染色體片段內的候選基因［11］。這種方法被稱為系統遺傳學方法(systems genetics)［12］。另一種方法稱為關聯研究(association studies)［13］。該研究方法直接將性狀的差異性與基因序列的差異性進行關聯。如目前迅猛發展的全基因組關聯分析(Genome-wide association study;GWAS)，應用基因組中數以百萬計由單個核苷酸變異所引起的變異DNA序列為分子遺傳標記，進行全基因組水平的對照分析或相關性分析，發現影響復雜性狀的基因變異［14］。從2005年《科學》雜志報道了第1篇重要的GWAS研究論文，到現在10年的時間里，GWAS研究成果呈爆炸性增長，發現了許多影響不同疾病的基因。GWAS相對于連鎖研究的優勢是能直接鑒定影響特定表型的基因或DNA序列。此方法可以直接對證候、體質等不同中醫表型與全基因組范圍的遺傳變異性直接關聯，可作為解析影響中醫證候分子基礎的非常有力的工具。此分析不需要對所研究對象的機制作任何假設，這對中醫證候研究特別重要而有用，因為許多證候產生的原因及其細胞和組織病位生理基礎都不明確。目前證候的GWAS臨床研究從技術手段上是具備的，還應盡早開展相關研究。

3 利用模式動物進行中醫證候GWAS研究的展望

除人群研究之外，還可以從合適的動物模式系統進行證候的GWAS研究。在各種人群研究中，即使在實驗控制的條件下，也很難獲得大量的有關疾病所涉病位的組織樣本進行分子機制上的分析(如進行心臟或腦區的基因表達)。因此需要嚴格控制的基因組和環境，又忠實地反映群體的遺傳復雜性及個體差異性的實驗系統。在這方面，模式動物特別是小鼠具有獨特的優勢。小鼠的基因組85%以上與人相似［15］，目前各國研究者已經培育出幾百種基因組系統變化的遺傳參照品系，在研究復雜性狀遺傳學上發揮了基礎性的作用。運用小鼠進行復雜性狀的GWAS研究不僅理論與實踐上可行，其研究成果也在《自然—遺傳綜述》等雜志上引起廣泛關注，成為一個重要方向［16］。充分利用小鼠遺傳信息優勢，對不同品系的近交系小鼠及重組近交系(由2種近交系小鼠雜交重組后產生的近交系)小鼠進行分型，是眾多小鼠GWAS研究方法中應用性最強的方法。其最大的優點是，由于每個近交系小鼠品系的基因型信息是確定一致的，只需要進行一次基因分型，這樣便可以節省大筆用于基因分型的費用。其次，近交系及其雜交子一代小鼠具有同基因(isogenic)性，便于獲得穩定的基底及造模表型值，提高了關聯分析的精確性和有效性。為增加遺傳統計效力，還使用了重組近交系小鼠，目前約300多種。其中種群數量最多、研究使用也最廣的是由C57BL/6J和DBA/2J 2個品系衍生而來的BXD重組近交小鼠品系［17］，已有100多種，以該品系為基礎的genenetwork．org網站已成為分析基因網絡遺傳調控的重要工具和數據庫［18］。近年來，國際上還進一步將多種近交系進行重組近交，獲得了遺傳多樣性和重組性大為增強的新一代重組近交系小鼠(collaborative cross)［19］。這些基因組各異但是遺傳信息確定的小鼠共同組成了遺傳參照種群［20］，可以利用不同水平的遺傳參照種群小鼠進行多元化的全基因組關聯研究。

小鼠是中醫證候研究的主要模式動物之一，目前已經積累了大量的研究資料，部分證候模型的有效性也獲得了多方面的驗證［21］。如方肇勤研究組對小鼠的四診模型進行了探索，結果顯示小鼠可表現出與臨床相似的中醫證候，并在標準化、客觀化和數量化上體現出特定優勢［22］。他們以及其他研究人員還進行了不同小鼠品系的比較，發現了品系間中醫證候表現的差異，提示遺傳對病證差異性的影響［23］。通過對中醫證候表現可重復性的量化分析，將其基因組變異性與其基因表達組、蛋白組等差異性進行關聯，還可以從系統水平揭示中醫證候易感性的物質基礎及中醫辨證論治個性化醫療的生物學本質。而多種系統性基因組差異小鼠種群的建立，也為中醫各種系統生物學研究提供了穩定可重復的平臺。小鼠的GWAS方法用于疾病或生理性狀的研究已獲得令人矚目的成功，證明它可作為闡釋多基因疾病的分子基礎的重要手段。這種方法也可以在揭示中醫證候的分子基礎的研究中發揮重要作用。但是，由于目前國內近交小鼠品系數量較少，其遺傳資源還相對匱乏，實驗費用相對較高等原因，小鼠的GWAS研究還開展得不多。針對這些問題，我們提出并實施了引進利用國內外小鼠遺傳參照種群，建立系統生物學實驗平臺，開展病證復雜性狀遺傳學研究的計劃。以抑郁癥小鼠病證模型為重點進行了前期研究，結果支持證候表現的遺傳效應［24］，為下一步進行GWAS研究打下良好基礎。

4 結語

傳統中醫臨床實踐重視人的生物系統性及人與自然和社會環境的協調統一性，很早就注意到疾病的發生發展及病證表現的多樣性依人群、個體稟賦及環境而有別的現象，提出了“因人因時因地”治宜的區別化診療理論，這與西方醫學隨著基因組學的快速發展而勃興的“個性化醫學”方向是一致的［25］。復雜性狀遺傳學和GWAS的運用，將有利于揭示中醫證候的分子及網絡物質基礎，也為復方的個性化多靶點多層次協同運用治療疾病提供了依據。可以預期，充分利用小鼠在中醫證候的定量化與標準化上的模型優勢［26］以及系統化可知的實驗小鼠的基因組變異的遺傳優勢，將為中醫基礎理論及中醫學研究的創新發展和推廣應用的飛躍性提高作出貢獻。

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Perspectives on the TCM Zheng Research Using Genome-Wide Association Study Approach

CHEN Gang，ZHOU Xin，XUE Wen-da，WU Hao-xin
(Center for Translational Systems Biology and Neuroscience，and Key Laboratory of Integrative Biomedicine of Brain Diseases，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

The scientific nature of TCM Zheng is a key for understanding the hallmarks and advantages of TCM in treatment based on Zheng differentiation and personalized medicine．It is also a fundamental theme of TCM research but remains largely unclear．Here by introducing the concept of complex trait genetics，the authors propose to use related methods，particularly the approach of cutting-edge genome-wide association study(GWAS)to dissect the molecular genetics of the individual differences in TCM Zheng．Moreover，the authors discuss the practicability and necessity to study the molecular and systematic networks underlying Zheng，by taking advantage of genetic reference mouse population resources，and point out the plausible advancement to TCM research and clinic by applying GWAS to validated models of disease-Zheng in the informative mouse population．

TCM Zheng;Complex trait genetics;GWAS;Genetic reference population mice;Model animal

R2-03

A

1006-3250(2017)01-0141-03

2016-06-12

國家自然科學基金資助項目(81673625)-基于PACAPCREB信號通路的越鞠丸快速抗抑郁機制研究;江蘇省自然科學基金青年基金項目(BK20140962)-基于GWAS分析策略研究越鞠丸抗抑郁作用的分子機制研究;江蘇省雙創項目(2013455)-中醫辨證治療抑郁癥的系統生物學研究;江蘇六大人才高峰項目(2013-YY-11);南京中醫藥大學自然科學基金青年基金項目(13XZR006)-基于“五志化火”探討梔子抗抑郁作用特點及其機制研究;中醫學江蘇省優勢學科中醫系統生物學及腦病學創新團隊

陳 剛(1972-)男，湖北武漢人，教授，醫學博士，博士研究生導師，從事重大腦病中醫藥治療的分子與系統生物學研究與中醫證候及方劑的系統遺傳學和系統生物學研究。