弓形蟲疫苗研究進展

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剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)簡稱弓形蟲，是一種人獸共患的細胞內專性寄生物，宿主廣泛，幾乎可以感染所有溫血動物[1]，宿主常常通過飲用受弓形蟲卵囊污染的水、攝入未煮熟的肉或者食物感染[2]，也可通過胎盤傳染給胎兒。免疫功能低下以及先天免疫缺陷的人群感染后可造成嚴重后果，甚至死亡。近年來，我國畜牧業迅速發展，養寵物的人也越來越多，弓形蟲病發病率逐年增高，嚴重影響畜牧業生產以及人身健康。弓形蟲病至今尚無理想的治療藥物，因此研制安全、有效的弓形蟲疫苗尤為重要。

1956年Cuchins等人利用蟲體粗抗原提取物研制出了最早的弓形蟲疫苗[3]，屬于滅活疫苗。伴隨著現代科學技術的發展和研究的深入，科研工作者們研制出了更多類型的弓形蟲疫苗，主要包括全蟲疫苗、基因缺失疫苗、基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗，現階段研究較多的是后3種。

1 弓形蟲全蟲疫苗

1.1滅活疫苗 滅活疫苗是將蟲體的多種組分抗原提取物經理化方法滅活，再添加適當的免疫佐劑制成疫苗。滅活疫苗安全性很高，但不能誘導宿主產生較強的抗弓形蟲保護免疫，免疫效果并不理想，只有部分疫苗能在一定程度上能降低實驗動物的死亡率。2004年Saavedra等人提取Wiktor蟲株的速殖子可溶抗原[4]，添加佐制成疫苗，免疫BALB/c小鼠后接種RH蟲株的速殖子，發現該疫苗雖然能夠誘導機體產生Th1型免疫應答，但IFN-γ水平很低，由該疫苗誘導的特異性保護作用是暫時的，無法抵抗RH蟲株的感染。

1.2弱毒活疫苗 弱毒活疫苗是將病原經過人工處理，如紫外線、放射線以及化學試劑等處理，最大程度削弱其致病性，但仍具有一定的毒力和免疫原性。利用弓形蟲速殖子制成的弱毒活疫苗可以誘發機體產生與天然主動免疫相似的免疫應答，其免疫效果強于滅活苗[5]。唯一針對弓形蟲的弱毒活疫苗Toxovax是利用傳代致弱的S48蟲株制成的[6]。S48蟲株最初是由Buxton等人于1956年在新西蘭從流產的羊體內分離出來[7]，其速殖子在小鼠體內經過3 000次以上傳代后，喪失了形成組織包囊或卵囊的能力。Montoya等人研究發現Toxovax疫苗誘導的免疫主要涉及CD4+和CD8+T細胞以及IFN-γ[8]，但該疫苗僅用于羊。2014年Katzer等人利用S48蟲株速殖子制成弱毒苗[9]，用該疫苗免疫羊后能明顯減少體內寄生蟲數量，降低肌肉和中樞神經系統病變程度，但未完全阻止組織包囊的形成。2015年Burrells等人用免疫了S48蟲株弱毒苗后再接種M4蟲株卵囊和未免疫而直接接種卵囊的兩組豬的組織提取物接種小鼠[10]，結果顯示，接受前一組豬組織提取物的小鼠存活率為100%，而接受后一組豬組織提取物的小鼠存活率為51.1%。但結果只表明接種該種疫苗會減少豬體內弓形蟲包囊數量，卻并未完全阻止包囊的形成。此外，致弱蟲株毒力恢復野生型也是不可忽視的一個問題，尤其針對免疫功能低下的動物或人群，這將可能出現弓形蟲再次感染發病和傳播疾病的風險。

2 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是利用基因工程技術將強毒株的毒力相關基因敲除后構建的活疫苗。氨基甲酰磷酸合成酶II(CPSII)基因是參與嘧啶合成的第一個酶，若破壞這種酶可造成蟲體尿嘧啶營養缺陷型，無法完成復制和生長。2002年Fox等敲除RH蟲株CPSII基因獲得了尿嘧啶營養缺陷型突變株[11]，并將其接種于BALB/c小鼠，結果顯示尿嘧啶營養缺陷型蟲株不僅對免疫功能正常的小鼠無致病力，對缺乏IFN-γ的小鼠也無致病力，由此推測尿嘧啶營養缺陷型蟲株可誘導小鼠產生對弓形蟲病的長期免疫。

雖然利用尿嘧啶營養缺陷型蟲體制成疫苗對預防弓形蟲急性感染很有效，且具有終生性，但能否預防弓形蟲慢性感染還是未知的。為了解決這個問題，2015年Fox等人首次通過敲除基因Ⅱ型Δku80蟲株的乳清苷5′-單磷酸脫羧酶(OMPDC)和尿苷磷酸化酶(UP)基因，構建了非復制型尿嘧啶營養缺陷型活疫苗[12]，該疫苗具有不返祖特點，能刺激小鼠產生CD8+T細胞依賴性免疫應答，預防弓形蟲急性和慢性感染。OMPDC是參與弓形蟲在動物體內進行復制和形成包囊的重要毒力基因，它的缺失可引起嚴重的尿嘧啶營養缺陷，使速殖子喪失復制功能，失去形成包囊和發展慢性感染的能力。此外，該疫苗不返祖，能克服致弱蟲株恢復野生型的風險，可作為進一步開發弓形蟲疫苗的新工具。

乳酸脫氫酶(LDH) 能催化丙酮酸和乳酸在厭氧生長條件下的相互轉化，用于能量供應，在弓形蟲不同時期會表達不同的亞型，速殖子僅表達LDH1，緩殖子主要表達LDH2。2017年Abdelbaset等人研發了LDH1基因缺失苗、LDH2基因缺失苗以及兩基因均缺失的活疫苗[13]。結果表明，LDH1基因缺失苗能降低弓形蟲急性感染的毒力，影響緩殖子的分化，顯著減少緩殖子階段包囊在體內的形成。LDH2基因缺失苗也會減少緩殖子階段包囊的形成，但不會影響蟲株毒力和緩殖子的分化。LDH1和LDH2基因均缺失的疫苗則更明顯的減少了緩殖子階段包囊的形成。使用低劑量的LDH基因缺失苗免疫小鼠即可對致死劑量的弓形蟲感染起到有效的保護作用。由此揭示了LDH基因與弓形蟲毒力有關，LDH基因缺失苗能夠有效減慢緩殖子的分化復制，預防慢性感染，可用于理想弓形蟲疫苗的研發，但LDH1和LDH2在寄生蟲無性生殖期的確切作用尚不清楚，還需進一步研究。

3 基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗

頂端復合體細胞器分泌抗原如棒狀體蛋白(ROP)、微線體蛋白(MIC)和致密顆粒蛋白(GRA)等，在蟲體入侵宿主細胞、運動以及增殖過程中具有非常重要的作用。近年來許多學者針對弓形蟲SAG、ROP、MIC、GRA、TgSPATR和TgEF-1α等抗原基因進行了深入的研究，將其作為疫苗候選分子，研制出了多種基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗。單基因疫苗免疫效果不理想，通過把生活史不同階段的多個特異組分抗原聯合，制成復合基因疫苗，可以彌補不足，是現今研究的一個發展方向。

3.1基因工程亞單位疫苗 目前棒狀蛋白研究較多的是 ROP1和ROP2家族，其中ROP2家族包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP、ROP8、ROP16、ROP18等蛋白。ROP5能使由GTP酶誘導的IFN-γ失活，幫助弓形蟲逃避宿主的免疫攻擊。ROP18是強毒I型弓形蟲基因組中最重要的毒力分型基因，ROP18蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性[14]，在感染的不同階段分別靶向宿主免疫相關因子IRGs和ATF6，分別抑制宿主的固有性和適應性免疫應答，使弓形蟲具備急性強毒力。迄今為止，關于ROP5和ROP18的免疫原性及其誘導的免疫應答機制的研究相對較少。2015年Grzybowski等人構建了ROP5和ROP18復合的亞單位疫苗[15]，通過動物保護性實驗發現該疫苗引起的體液免疫比較溫和，不會劇烈產生IgG抗體。將Chinese1型弓形蟲ROP16Ⅰ/Ⅲ克隆，在插入真核表達載體PEGFP1中在進行轉染體外觀察發現，其分泌位置和結構特點，不能誘導小鼠產生IgG來抵抗弓形蟲感染[16]。此外，2016年Ching等人建立了GRA2和GRA5復合基因亞單位疫苗[17]，能引起體液免疫和以Th1型為主的細胞免疫，IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10細胞因子以及IgG抗體水平顯著升高，可對弓形蟲急性感染產生部分保護作用。

弓形蟲延伸因子(TgEF-1α)在真核細胞中高度保守且普遍表達，2017年Wang等人構建了TgEF-1α基因工程亞單位疫苗[18]，能抵抗致死量速殖子對小鼠的攻擊，抑制速殖子入侵巨噬細胞，IFN-γ和IL-4細胞因子水平升高，MHC-I和MHC-II分子表達增多，CD4+和CD8+T細胞百分比顯著增加，小鼠存活時間延長。

3.2 核酸疫苗

3.2.1DNA疫苗 弓形蟲表面抗原(SAG)能參與宿主細胞的粘附，刺激宿主產生免疫應答[19]，具有較高的免疫原性和免疫保護性，可刺激機體產生IgG、IgM、IgA抗體以及細胞因子IFN-γ等殺死蟲體。2013年Zhang等人構建了表達SAG2C，SAG2D，SAG2X以及3種基因復合的DNA疫苗[20]，免疫BALB/c小鼠后均可引起IgG抗體水平顯著升高，淋巴細胞大量增殖，產生劇烈的Th1型免疫應答，IL-2和IFN-γ等細胞因子水平也有所增高，能有效對抗基因II型蟲株卵囊的感染，腦組織包囊減少率分別達到72%，23%，69%和77%，特別是3種基因復合的DNA疫苗能有效保護小鼠抵抗弓形蟲慢性感染。

弓形蟲在入侵的早期階段能分泌一種含有血小板反應蛋白重復結構域的蛋白(TgSPATR)，并以Ca2+依賴性微線體蛋白形式釋放，在弓形蟲粘附和侵襲中發揮重要作用[21]。瘧原蟲也可分泌此類蛋白(PfSPATR)。臨床志愿者實驗顯示，臨床免疫成年人的血清可以識別PfSPATR，而含抗瘧原蟲子孢子抗體水平很低的志愿者血清和對照組的血清不能識別PfSPATR，表明宿主免疫系統可以識別PfSPATR。此外，PfSPATR抗體已被證實能夠抑制瘧原蟲子孢子侵襲人的肝細胞。TgSPATR與PfSPATR是同源物，因此，它可能具有與PfSPATR類似的功能。2017年Zheng等人首次制備了pVAX1-TgSPATR DNA疫苗[22]，免疫小鼠后獲得了較好的保護效果，IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-10細胞因子和IgG抗體水平顯著升高，能夠誘導Th1/ Th2型細胞免疫以及體液免疫，與未接種疫苗的小鼠相比，在接種RH蟲株速殖子后存活時間明顯延長，但不能抵抗高劑量RH強毒株的感染。此外，2014年Hassan等人用編碼弓形蟲脫氧核糖磷酸醛縮酶(TgDPA)的DNA疫苗免疫小鼠，產生了很強的體液免疫和細胞免疫，存活率升高[23]。

3.2.2RNA疫苗 利用mRNA作為疫苗的想法已流行了30年左右，它可誘導宿主細胞產生由它們編碼的許多蛋白，觸發強大的免疫反應。2006年Dimier-Poisson等人從弓形蟲速殖子中提取了編碼SAG1的mRNA[24]，研發出了通過鼻內免疫的RNA疫苗，免疫C57BL/6小鼠后可得到較好的保護效果，能有效對抗致死量76K弓形蟲包囊的攻擊，存活率提高了50%，并能減少亞致死量76K弓形蟲包囊攻擊時腦組織包囊的形成。2016年Chahal等人首次開發出一種完全保護性的單劑量RNA納米顆粒疫苗[25]，該疫苗含有編碼弓形蟲GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A和AMA1蛋白的mRNA，并由樹狀大分子納米顆粒包被，可在幾天內生產出來，快速應對疾病的暴發，用該疫苗免疫小鼠后可引起CD8+T細胞數量增多，誘導體液免疫，在接種致死量基因II型PRU蟲株后6個月依然沒有臨床癥狀，且能同時預防埃博拉病毒和H1N1流感病毒，是首個能對廣譜致死性病原體起保護作用的疫苗，但仍需進一步實驗驗證其保護作用的長期性與穩定性，以及是否可以應用于人類和其他動物。

綜合結果分析，各種抗原基因的DNA疫苗和基因工程亞單位疫苗在一定程度上降低了實驗小鼠的死亡率，顯示出引起Th1型細胞免疫的優勢，可誘導CD8+T細胞產生IFN-γ起主導作用來抗擊弓形蟲的感染，但其免疫保護效果仍不夠理想，不能完全預防組織包囊形成，盡管對弓形蟲感染具有良好的保護作用，但不能完全保護小鼠免于死亡，還需要進一步改善。RNA疫苗不能整合到宿主基因組中，比DNA疫苗更安全，不會導致突變產生，但目前研究并不是很多，研究出能將其安全、有效的遞送至體內的方法是RNA疫苗成功的關鍵之一。

4 人用弓形蟲疫苗的初步探索

許多用小鼠作實驗動物的疫苗研究有助于我們了解控制弓形蟲感染的免疫機制。然而，弓形蟲易感性因蟲株種類、MHC多樣性和感染途徑的不同而不同[26]，且考慮到小鼠和人之間的免疫反應差異，小鼠模型不足以識別保護性抗原[27]。針對小鼠模型的保護性評估很難用于分析推斷人體的免疫應答。開發能表達人MHC I分子的轉基因小鼠是目前研究人用弓形蟲疫苗的有效替代方法。首先合理選擇免疫原性多肽，然后在表達人MHC I分子的小鼠中進行測試。已有學者使用生物信息學方法鑒定了幾種HLA-A03超型限制性弓形蟲衍生肽，然后通過免疫HLA-A*1101轉基因小鼠評價其保護功效。結果表明，這些肽可以引起人CD8+T細胞和小鼠脾細胞產生IFN-γ，可用于預防HLA-A03超型弓形蟲病。也有學者證明了HLA-A * 0201和HLA-B * 0702限制的衍生肽的免疫原性。

5 展 望

盡管弓形蟲疫苗研究已取得了較大進展，但這些疫苗或多或少都存在一些缺陷，無法完全預防和控制弓形蟲病的感染和傳播。理想的弓形蟲疫苗應包含弓形蟲整個生活史的重要抗原組分，目前多數疫苗研究主要針對速殖子階段，可以加深對緩殖子的研究，例如阻止緩殖子在體內轉化為速殖子。此外，目前商品化弓形蟲疫苗主要針對綿羊和山羊，針對豬、貓和人類的弓形蟲疫苗依然很缺乏。預防食品加工用動物組織包囊的形成也是預防弓形蟲病的重要環節之一。可對弓形蟲生活史、各階段的保護性抗原結構及其編碼基因、與宿主之間的關系進行深入的研究，探索新的保護性抗原，尋找能被免疫反應有效阻斷的重要抗原，開發新型分子佐劑、免疫增強劑以及高效載體等，研制出安全、有效的弓形蟲病疫苗。有效的弓形蟲疫苗的研發，將從根本上切斷蟲體侵入細胞的途徑，從源頭上阻斷其感染與傳播，從而將弓形蟲防控提升到更高的水平。為防控畜禽弓形蟲感染、提高養殖業效益、保障畜牧業可持續發展和畜產品質量安全提供可靠的技術支撐。

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