偽結核棒狀桿菌毒力因子的研究進展

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兼性胞內寄生菌偽結核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)可感染馬、牛、羊、豬、駱駝等多種動物和人，是慢性傳染病干酪樣淋巴結炎(Caseous lymphadenitis，CLA)的重要病原[1]，以被感染動物體表淋巴結、內臟器官膿腫及干酪樣病變為特征[2-4]。在臨床上，偽結核棒狀桿菌以感染小反芻動物最為普遍，尤其是山羊和綿羊[1, 3]。據世界動物衛生組織(OIE)統計，全球至少有64個國家確認有該病的存在[2]，目前，我國關于偽結核棒狀桿菌感染引起羊和駱駝發病的報道超過30篇，其流行率甚至高達30%[5-6]。偽結核棒狀桿菌一旦傳入羊群，極難控制和根除，是造成養羊業重要經濟損失的原因之一[1-2]。不僅如此，該病原感染可引起人的淋巴結炎、嗜酸性粒細胞肺炎及心內膜炎等，對人類健康具有潛在的威脅[7]。因偽結核棒狀桿菌毒力因子與其感染致病密切相關，成為人們研發偽結核棒狀桿菌的新疫苗或治療檢測手段的標靶[8]。本文就偽結核棒狀桿菌毒力因子的研究概況進行綜述。

1 磷脂酶 D

磷脂酶(phospholipase)是致病菌的一種重要毒力因子，該酶通過水解細胞膜磷脂的磷酸酯鍵，從而破壞宿主細胞膜，引起細胞功能紊亂和喪失[9]，與病原菌的存活和傳播直接相關[10]。磷脂酶 D(Phospholipase D，PLD)是偽結核棒狀桿菌最重要、研究最早的毒力基因之一。PLD最早由Carne(1940)在偽結核棒狀桿菌中發現[11]，隨后在該病原感染哺乳動物的所有分離株中均檢測到PLD[12]。在棒狀桿菌屬細菌中，只有偽結核棒狀桿菌(C.pseudotuberculosis)和潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)能產生PLD[13]。偽結核棒狀桿菌PLD由pld基因編碼，所編碼的蛋白包括一個假定信號肽(約2.7 kDa)和PLD成熟蛋白(31.4 kDa)[14]。

偽結核棒狀桿菌PLD具有多種生物學活性，可引起皮膚壞死，高劑量PLD對試驗動物和家畜具有致死性, 與胞外馬紅球菌具有協同溶血作用，能抑制葡萄球菌溶解素誘導的紅細胞溶解(Baird等[3]綜述)。偽結核棒狀桿菌PLD通過水解動物細胞膜鞘磷脂的酯鍵而增加血管滲透性，導致血漿從血管滲出進入周圍組織，使病原菌能夠從嗜中性粒細胞逃逸，并且損害朝向感染部位的嗜中性粒細胞趨化性[15]。研究發現敲除或使pld基因失活，該病原均不能造成感染羊的淋巴結膿腫和CLA[16]。PLD特異性抗體能限制該病原感染引發的臨床疾病病程[3]。

PLD是偽結核棒狀桿菌的主要保護性抗原，常被用于防制該病原的疫苗研發[17]。目前生產的疫苗通常為福爾馬林滅活的富含PLD的偽結核棒狀桿菌培養物上清液，或基于PLD研究的DNA疫苗[18]。Hodgson等[19]研究發現pld基因缺失的偽結核棒狀桿菌弱毒株Toxminus單次皮下接種，可對野生型偽結核棒狀桿菌感染綿羊具有保護性。

最近，Combs等[20]研究發現，偽結核棒狀桿菌分泌鞘磷脂酶D(secretes sphingomyelinase D, SMase D)可抑制人T細胞鈣池操縱的鈣進入(store-operated Ca2+entry，SOCE)，降低SOCE依賴細胞因子IL-2和TNF-α的產生。SMase D通過抑制鈣釋放激活鈣通道蛋白流(Orai1 current)而不是改變電壓門控K+通道，以抑制SOCE。研究認為雖然某些基因突變消除Orai1活性(Orai1 activity)造成嚴重的聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)，但是偽結核棒狀桿菌通過SMase D抑制Orai1活性，創建SCID樣環境以維持細菌的持續感染。該研究揭示了偽結核棒狀桿菌毒力因子通過宿主細胞膜中的靶向磷脂破壞關鍵膜蛋白功能，以阻止宿主免疫力的新機制。

此外，pld基因還被用于偽結核棒狀桿菌臨床檢測研究。Pacheco等[21]以pld、rpoB和16SrRNA基因開發的多重PCR方法，可將偽結核棒狀桿菌與其他密切相關的潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)和白喉桿菌(C.diphtheriae)等棒狀桿菌屬病原區分開，為臨床上直接診斷CLA提供了準確診斷方法。

2 分枝菌酸

偽結核棒狀桿菌無莢膜，但有蠟狀的分枝菌酸(mycolic acid)包裹在菌體表面。偽結核棒狀桿菌分枝菌酸具有細胞毒素特性，與其致病性相關，對小鼠皮下注射該病原的分枝菌酸提取物，可引起局部腫脹、淤血和中心區域出血性壞死[3]。與其他放線菌科病原相似，偽結核棒狀桿菌的分支菌酸外套(mycolic acid coat)能保護該病原在外界環境中的存活。在自然感染中，偽結核棒狀桿菌的分枝菌酸外套為其提供了機械性的，或者生物化學性的保護，以避免溶酶體內水解酶的作用，從而保護細菌能作為一種兼性寄生菌在吞噬細胞和宿主機體內存活[3, 22]。這對該病原從最初感染部位遷徙到最終部位可能很有必要。此外，分枝菌酸可能促成了膿腫的形成，研究發現偽結核棒狀桿菌不同分離株細胞壁脂質含量與其感染小鼠引發慢性膿腫的能力直接相關[23]。

3 σ因子

細菌σ(sigma，σ)因子是RNA聚合酶的必要組分并決定啟動子的選擇性。σ因子的替換可重新定向細胞內的一些或所有RNA聚合酶以激活或沉默基因的轉錄[24]。致病性胞內細菌可通過RNA聚合酶的選擇性σ因子瞬時激活應激反應基因來響應宿主細胞的抗微生物機制[25]。因此，選擇性σ因子在調節細菌毒力相關基因表達，促進致病菌感染宿主、胞內存活和擴散中發揮重要作用[24-25]。選擇性σ因子胞質功能(extracytoplasmic function，ECF)家族蛋白，如sigE(σE)，主要調節細胞表面應激，控制不同致病菌毒力相關基因的表達[24]。研究發現σE與吞噬細胞內脅迫條件下的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)轉錄應答和細菌在胞內存活有關[26]。此外，sigE是結核分枝桿菌的一小類在響應亞硝化脅迫時選擇性上調的基因[27]。近年來，Pacheco等[28]研究證實偽結核棒狀桿菌在抵抗體外生成的生物相關濃度一氧化氮(NO)時確實需要σE。偽結核棒狀桿菌sigE無效突變株(ΔsigE)在體外對酸性pH、細胞表面應激源和生物相關濃度一氧化氮(NO)更敏感。ΔsigE突變株不能在C57BL/6小鼠中持續感染，但能在缺乏誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的小鼠中保持感染性。同時發現σE在偽結核棒狀桿菌感染期間抵抗NO/過氧化物應激脅迫中發揮作用。

4 寡肽透過酶

寡肽透過酶(oligopeptide permease，Opp)轉運蛋白位于質膜中，通常與胞外環境攝取肽有關。同時Opp還參與調節細胞間信號傳導，控制致病細菌毒力基因的表達等[29]。Opp屬于ABC轉運蛋白家族中的一類多亞基蛋白復合物，該家族以水解三磷酸腺苷(ATP)產生的能量來驅動脂質、肽和糖的跨質膜轉運[30-31]。Opp轉運蛋白由排列于操縱子中OppA、OppB、OppC、OppD和OppF 5個蛋白質亞基組成。通常OppA亞基負責捕獲來自胞質外環境的肽并將其轉移到跨膜的通道—形成蛋白(channel-forming proteins)。 OppB和OppC亞基負責形成跨膜通道，通過該通道寡核苷酸被轉運至細胞內環境。OppD和OppF亞基位于細菌細胞膜的胞質部分負責ATP水解，所產生能量用于肽的內化過程[31-32]。Moraes等[29]研究發現，與偽結核棒狀桿菌野生型菌株相比，當暴露于有毒的谷胱甘肽(GSH)，OppD缺失菌株(ΔoppD)生長受損，表明Opp對肽的內化不是必需的，偽結核棒狀桿菌可通過其他途徑來完成。此外，與野生型相比，ΔoppD突變體對巨噬細胞的粘附和感染能力下降，但是oppD突變不影響該菌對小鼠的致病力。

5 與鐵攝取和調節相關毒力因子

研究表明分別由偽結核棒狀桿菌PLD基因下游的FagA、FagB、FagC、FagD編碼的完整膜蛋白、鐵腸菌素轉運子、ATP結合胞質膜蛋白和含鐵細胞-鐵結合蛋白與細菌的鐵攝取系統蛋白具有32%～47%同源性[33-34]。FagA、FagB、FagC、FagD均由一個操縱子控制，參與鐵的攝取，這些基因在富含鐵的培養基中極少表達，而在缺乏鐵環境下高水平表達，對偽結核棒狀桿菌在山羊體內持續感染中發揮重要作用，研究表明該病原FagB(C)突變可降低其對山羊體內感染的致病性[33]。Aquino等對分離自綿羊和山羊的168株偽結核棒狀桿菌研究發現，FagA和FagB檢出率為100%，FagC和FagD基因相對檢出率稍低，但其比例也超過了95%。與內臟中分離的偽結核棒狀桿菌相比，所有未檢出FagD基因的分離株均來自于表面膿腫，提示各臨床分離株間潛在毒力以及FagD基因在參與偽結核棒狀桿菌入侵宿主中有差異[34]。

6 其他毒力因子

雖然偽結核棒狀桿菌編碼II型3-脫氫奎特酶aroQ基因缺失后，對小鼠的致病力下降，同時可以引發機體的免疫反應，具有研發疫苗的潛力[35]，但是因aroQ基因缺失可能與其影響偽結核棒狀桿菌芳香族化合物葉酸的合成有關，不宜認定為毒力因子。近年來，人們通過對分離自一個12歲女孩淋巴腺炎的偽結核棒狀桿菌全基因組測序和分析，鑒定出小菌毛蛋白(SpaC)、神經氨酸酶或唾液酸酶(NanH)、真核樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶G(PknG)以及分泌銅、鋅依賴的超氧化物歧化酶(SodC)等假定的毒力基因[13, 36]。SpaC可與宿主細胞受體結合，促進其他的配體—受體相互作用，增強毒力因子傳遞效率和胞內入侵[37]。NanH屬于一類糖基水解酶，催化糖復合物去除唾液酸殘基末端，有助于病原識別暴露在宿主細胞表面的唾液酸，與病原的致病作用相關[38-39]。PknG影響巨噬細胞中結核分枝桿菌的胞內運輸，大多數微生物和非致病性分枝桿菌在溶酶體中可被快速地發現和殺死。而結核分枝桿菌可停留在吞噬體中，通過釋放PknG以阻斷吞噬體-溶酶體融合。 缺乏pknG基因的細菌被迅速轉移到溶酶體消除[40-41]。SodC是一種脂質體基序，可能錨定在細胞膜中[36]，該酶的胞外位置表明其可能對偽結核棒狀桿菌細胞表面有保護作用，以抵抗哺乳動物宿主細胞外部產生的超氧化物[13]。結核分枝桿菌中，SodC有助于該病原抵抗巨噬細胞激活產生的氧化暴發產物[42-43]。在其他細菌如腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)和杜克雷嗜血桿菌(Hemophylusducreyi)中，Cu、Zn-SOD保護活性與其毒力有關[36]。最近，Silva等通過比較蛋白組學研究顯示體外培養和經小鼠體內傳代的偽結核棒狀桿菌有118個差異表達蛋白，其中除PLD外，還有CP40蛋白酶、耐銅蛋白(CopC)、與細胞粘附相關的蛋白(LPTXG domain)、與解毒相關的抗活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的蛋白及谷氧還原蛋白樣蛋白(NrdH)、以及對抗菌藥物抵抗作用有關的青霉素結合蛋白和金屬β-內酰胺酶等[44]。雖然偽結核棒狀桿菌具有以上一些假定毒力因子，其中的一些毒力因子具有用于防制CLA疫苗開發的良好潛力[13]，然而它們的功能還有待進一步深入研究和鑒定。

7 展 望

自1888年發現偽結核棒狀桿菌以來，人們對該病原開展了大量的研究，然而關于偽結核棒狀桿菌毒力和基因表達控制的分子機制研究仍然很有限。到目前為止，只有很少一些毒力相關基因得以描述，對于控制不同毒力表型以及偽結核棒狀桿菌羊種生物型(biovarovis)和馬種生物型(biovarequi)不同趨向性的機制仍然缺乏[45]。Carvalho等以不同應激條件下偽結核棒狀桿菌轉錄組信息篩選出了兩個表達最穩定的內參基因——編碼DNA促旋酶亞單位A(gyrA)和編碼延伸因子P(fusA)的基因[45]，為研究該病原毒力基因的表達提供了基礎。利用高通量測序數據，結合生物信息學知識和分子生物學研究手段，篩選和鑒定偽結核棒狀桿菌的毒力因子，并解析不同毒力因子的功能及在致病過程中的協同作用，對深入了解該病原的致病機理和候選疫苗抗原具有重要的理論和應用價值。

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