康復新液化學成分研究△

呂娜，沈連剛，李廣志，王鈞篪，斯建勇

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎研究·

康復新液化學成分研究△

呂娜，沈連剛，李廣志，王鈞篪，斯建勇

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：研究康復新液的化學成分。方法：采用硅膠、Sephadex LH-20柱色譜及半制備液相色譜分離，MS、NMR等波譜學技術鑒定化合物結構。結果：共得到并鑒定了13個化合物，分別為尿嘧啶(1)、次黃嘌呤(2)、cyclo-(Tyr-Gly)(3)、原兒茶酸(4)、肌苷(5)、丙三醇(6)、亮氨酸(7)、異亮氨酸(8)、苯丙氨酸(9)、酪氨酸(10)、纈氨酸(11)、丙氨酸(12)、甘氨酸(13)。結論：化合物3、4為首次從美洲大蠊提取物中分離得到。

美洲大蠊；康復新液；核苷；氨基酸；環肽

美洲大蠊，俗稱蟑螂，偷油婆等，是有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，見于除兩極之外的世界各地。雖為世界性衛生害蟲，但在我國西南民間有將其外敷治療傷口的習俗，據此大理學院的李樹楠教授開發研制出對各種外傷、潰瘍、瘺管、褥瘡的創面有良好效果的美洲大蠊單方制劑——“康復新液”，臨床應用廣泛，不良反應小。但因其藥效成分尚不明確，對于康復新液的質量標準的優化、制劑本身的推廣應用和市場國際化都形成了較多的阻礙。為此本實驗對康復新液的化學成分進行分離和鑒定，得到了13個化合物，分別是尿嘧啶(1)、次黃嘌呤(2)、cyclo-(Tyr-Gly)(3)、原兒茶酸(4)、肌苷(5)、丙三醇(6)、亮氨酸(7)、異亮氨酸(8)、苯丙氨酸(9)、酪氨酸(10)、纈氨酸(11)、丙氨酸(12)、甘氨酸(13)；其中化合物3、4為首次從康復新液中分離得到。

1 儀器與試劑

2435型分析液相色譜儀系統(美國WATERS公司)；梅特勒電子天平MS105DU(瑞士METTLER TOLEDO公司)；2535型半制備液相色譜儀系統(美國WATERS公司)；AVANCE Ⅲ 600MHz核磁共振儀(德國BRUKER公司)；LTQ-Obitrap XL液質聯用儀(Thermofisher)；四孔電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；JR-360D超聲清洗器(北京精銳澤祥實驗儀器有限公司)；薄層色譜硅膠板HSGF254(煙臺市化學工業研究所)。

康復新液(四川好醫生藥業集團)；次黃嘌呤對照品(批號：140661-200903)、肌苷對照品(批號：140669-201305)、尿嘧啶對照品(批號：100469-201302)，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其余試劑均為化學純。

2 方法與結果

2.1 樣品的分離

將康復新液濃縮液329.4 g用適量水混懸后，用三氯甲烷萃取，合并萃取液減壓濃縮得三氯甲烷溶性部位和水部位浸膏。將三氯甲烷溶性部位浸膏經甲醇溶解后與等量的硅膠(300～400目)拌勻裝柱，依次用三氯甲烷-甲醇(100∶0～0∶100，V/V)梯度洗脫，經TLC分析后合并得到10個主流分(Fr.A-Fr.J)。Fr.A，Fr.C，Fr.F，Fr.G，Fr.I，Fr.J各有不溶物析出，過濾后，將沉淀反復重結晶，經Sephadex LH20(甲醇-水)、制備型薄層硅膠板分離純化，從Fr.A中得到白色晶體1(14.7 mg)，從Fr.C中得到淺黃色晶體2(106.8mg)，從Fr.F中得到白色粉末7和8(7.3 mg)，從Fr.G制得白色粉末10(58.7 mg)和11(213.7 mg)，從Fr.I中得到白色粉末12(250.9 mg)，從Fr.J獲得黃色粉末13(1.6 mg)。

其次，Fr.C、Fr.D、Fr.E經過反復硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯)、制備型HPLC(甲醇-水)等色譜技術分離純化，又從Fr.C中得到白色針晶3(4.6 mg)，從Fr.D中得到褐色粉末4(14.3 mg)，白色晶體5(37.7 mg)，從Fr.E中得到淺黃色油狀物6(113.0 mg)，白色粉末9(24.6 mg)。

2.2 化合物結構鑒定

化合物1：白色晶體，用HPLC分析液相測得tR=6.698，與尿嘧啶對照品保留時間一致(tR=6.111)；與對照品混合點樣，經TLC分析后，確定該化合物為尿嘧啶。

化合物2：淺黃色晶體，用HPLC分析液相測得tR=9.635，與次黃嘌呤對照品保留時間一致(tR=9.883)，與次黃嘌呤對照品混合點樣，經TLC分析，確定該化合物為次黃嘌呤。

化合物3：白色針晶，環肽反應呈陽性，1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：9.29(1H，s，OH)，8.08(1H，s，NH)，7.84(1H，s，NH)，6.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-7′)，6.65(2H，d，J=8.4 Hz，H-4′，H-6′)，3.96(1H，d，J=3.0 Hz，Ha-4)，3.29(1H，s，J=3.0 Hz，Hb-4)，2.97(1H，dd，J=4.2 Hz，13.8 Hz，H-1′)，2.74(1H，dd，J=4.2 Hz，13.8 Hz，H-1′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：167.3(C-1)，165.7(C-3)，156.3(C-5′)，131.0(C-3′，C-7′)，125.7(C-2′)，114.9(C-4′，C-6′)，55.7(C-2)，43.6(C-4)，38.2(C-1′)，以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[1]，故鑒定該化合物為cyclo-(Tyr-Gly)，為首次分離得到。

化合物4：褐色粉末，1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH：7.40(1H，s，H-6)，7.39(1H，s，H-2)，6.78(1H，d，J=6.0 Hz，H-5)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC：170.3(C-7)，151.5(C-4)，146.1(C-3)，123.9(C-6)，123.3(C-1)，117.7(C-2)，115.8(C-5)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[2]，故鑒定該化合物為原兒茶酸，為首次分離得到。

化合物5：白色晶體，用HPLC分析液相測得tR=19.503，與肌苷對照品保留時間一致(tR=19.884)，與肌苷對照品混合點樣，經TLC分析，確定該化合物為肌苷。

化合物6：淺黃色油狀物，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.68(1H，m，H-2)，3.55(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Ha-1，Hb-1)，3.47(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Ha-3，Hb-3)，13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：72.1(C-2)，62.7(C-1，C-3)，以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[3]，故鑒定該化合物為丙三醇。

化合物7：白色粉末，茚三酮反應呈陽性，ESI-MS：m/z132.101 6 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：3.71(1H，t，H-2)，1.71(1H，m，H-4)，1.66(2H，m，H-3)，1.00(3H，t，H-5)，1.00(3H，t，H-6)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：175.5(C-1)，53.4(C-2)，39.8(C-3)，24.1(C-4)，22.0(C-5)，20.8(C-6)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[4]，故鑒定該化合物為L-亮氨酸。

化合物8：白色粉末，茚三酮反應呈陽性，ESI-MS：m/z132.101 6 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：3.60(1H，d，J=4.2 Hz，H-2)，2.26(1H，m，H-3)，1.71(2H，m，H-4)，1.25(3H，m，H-5)，1.46(3H，m，H-6)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：174.1(C-1)，59.5(C-2)，35.8(C-3)，24.1(C-4)，11.1(C-5)，14.5(C-6)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[4]，故鑒定該化合物為異亮氨酸。

化合物9：白色粉末，茚三酮反應呈陽性，ESI-MS：m/z166.053 1 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：7.50(2H，t，H-6，H-8)，7.45(1H，t，H-7)，7.40(2H，d，J=12.0 Hz，H-5，H-9)，4.06(1H，m，H-2)，3.36(1H，dd，J=6.0，18.0 Hz，Ha-3)，3.19(1H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Hb-3)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：174.0(C-1)，135.3(C-4)，129.5(C-6，C-8)，129.2(C-5，C-9)，127.8(C-7)，56.2(C-2)，36.5(C-3)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[5]，故鑒定該化合物為苯丙氨酸。

化合物10：白色粉末，茚三酮反應呈陽性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：7.17(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.88(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)，3.92(1H，q，H-2)，3.18(1H，dd，J=15 Hz，5.4 Hz，Ha-3)，3.03(1H，dd，J=15 Hz，7.8 Hz，Hb-3)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：174.2(C-1)，154.8(C-4′)，130.7(C-2′，C-6′)，126.8(C-1′)，115.8(C-3′，C-7′)，56.0(C-2)，35.8(C-3)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[4]，故鑒定該化合物為酪氨酸。

化合物11：白色粉末，茚三酮反應呈陽性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.59(1H，d，J=4.2 Hz，H-2)，2.26(1H，m，H-3)，1.02(3H，d，J=7.2 Hz，H-4)，0.97(3H，d，J=7.2 Hz，H-5)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：175.5(C-1)，60.3(C-2)，29.0(C-3)，17.9(C-4)，16.6(C-5)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[4]，故鑒定該化合物為纈氨酸。

化合物12：白色粉末，茚三酮反應呈陽性，ESI-MS：m/z90.054 7 [M+H]+；1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.69(1H，dd，J=7.2，14.4 Hz，H-2)，1.39(3H，d，J=7.2 Hz，H-3)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：175.8(C-1)，50.7(C-2)，16.2(C-3)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[4]，故鑒定該化合物為丙氨酸。

化合物13：黃色粉末，茚三酮反應呈陽性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.45(2H，s，H-2)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：172.2(C-1)，41.4(C-2)。以上波譜數據與文獻報道數據基本一致[4]，故鑒定該化合物為甘氨酸。

3 結果與討論

從結果來看，美洲大蠊體內富含核苷、氨基酸類物質，這與昆蟲藥本身的成分特點一致；其次本實驗分得一個肽類物質，之前也有學者從美洲大蠊提取物中得到幾種環肽類成分[6]，證實這類成分也是美洲大蠊的主要成分之一。有報道稱，在用美洲大蠊提取物的不同組分對造模動物的創面進行處理后，療效最好的組分經分析富集為小分子肽[7]；創面愈合是多種藥理活性作用的結果，如抗菌、抗炎、促進組織生長、提高免疫力等。目前已有大量研究表明藥用植物和海洋天然產物中得到的不少小分子肽具有很強的生物活性[8-9]，環脂肽類成分已經開發得到多種抗菌素[10]，由此可以推斷美洲大蠊體內的活性成分很可能也是肽類成分。因此筆者認為，從美洲大蠊體內獲得更多的肽類成分并進行活性篩選以及機制探究,將是未來此類藥材研究的趨勢和熱點之一，相信美洲大蠊作為最古老的中藥之一將得到更有效的開發利用。

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StudiesonChemicalComponentsofKangfuxinLiquid

LYUNa，ShenLiangang，LiGuangzhi，WangJunchi，SiJianyong*

(ChineseAcademyofMedicinalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，Beijing100193,China)

Objective：To study the chemical constituents of Kangfuxin Liquid.Methods：The chemical constituents were isolated and purified on silica gel column chromatography，Sephadex LH20 and semi-preparing liquid chromatography，and identified by MS and NMR.Results：Thirteen compounds were obtained and identified as following：uracil(1)，hypoxanthine(2)，cyclo-(Tyr-Gly)(3)，protocatechuic acid(4)，inosine(5)，glycerol(6)，leucine(7)，isoleucine(8)，phenylalanine(9)，tyrosine(10)，valine(11)，alanine(12)，glycine(13).Conclusion：Compounds3and4are isolated fromPeriplanetaamericanafor the first time.

Periplanetaamericana；Kangfuxin Liquid；nucleosides；amino acids；cyclic peptide

國家“重大新藥創制”科技重大專項(2012ZX09301-002-001，2011ZX09307-002-01)

] 斯建勇，博士生導師，研究員，研究方向：天然產物化學；Tel：(010)57833299，E-mail：jysi@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.003

2016-10-10)

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