腫瘤壞死因子受體相關因子6與骨代謝的研究進展

張群燕 郭郡浩 蔡輝

南京軍區南京總醫院中西醫結合科，江蘇 南京 210002

腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF6)是細胞內信號傳導通路上的關鍵接頭蛋白。因其能直接和CD40、IRAK以及NF-κB受體激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)相結合，進而激活轉錄因子NF-κB、JNK/p38、AP-1通路，影響細胞的生成、增殖、分化和死亡而備受關注[1,2]。骨代謝是骨組織不斷進行改建活動的一個復雜過程，包括骨吸收和骨形成兩個方面。近年來，有關TRAF6在骨代謝方面的研究較多，其結果頗具爭議，現就TRAF6在骨代謝中的研究進展作一綜述。

1 TRAF6蛋白結構及生物學功能

1994年，Rothe等利用酵母雙雜交技術和免疫沉淀反應發現了兩種能與TNFRⅡ特異性結合的胞內信號接頭蛋白并命名為TRAF1、TRAF2，隨后在哺乳動物中又發現幾種TRAFs蛋白，分別為TRAF1-TRAF6，并統稱為TRAF家族(tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs)。

TRAFs蛋白在進化上非常保守，且有著十分相似的結構特征[3]，即①TRAF分子C端都含有一個約200個氨基酸殘基的TRAF結構域，主要接受外來信號。其中，TRAF又分為TRAF-N和TRAF-C兩部分，TRAF-C可與不同受體蛋白胞內段的TRAF結構域或胞漿內其他含有TRAF結構域的蛋白結合，依賴TRAF-N端的環-環α螺旋結構(coiled-coil)形成同源或異源二聚體或多聚體。雖然有文獻將新的蛋白質被命名為TRAF7[4]，但這種說法是有爭議的，因為該蛋白不具有定義TRAFs的TRAF同源結構域。②除了TRAF1以外，TRAF分子N端依次有三個域，第45～106位是含有兩個鋅原子、7個半胱氨酸的環指模序(ring finger motif)，第110～264位有5到7個鋅指(zinc finger，ZF)結構域，第287～342位有螺旋輪結構。這種結構將膜上的信號傳導至下游，激發一系列信號通路，從而發揮不同的生物學功能[5]。

1996年，Ishida等[6]使用cDNA文庫的酵母雙雜交系統和篩選技術，發現TRAF6介導CD40參與NF-κB活化的信號轉導；隨后，Cao等[7]發現TRAF6可以與白細胞介素受體相關激酶(IL-1R-associated kinase，IRAK)綁定結合，在配體的刺激下，接頭蛋白MyD88通過保守的C端胞質結構域TIR(Toll/IL-1R homology region)被募集到IL-1R或TLR復合體上，參與NF-κB活化的信號轉導。

現已證實，人TRAF6基因定位于11p13，編碼的蛋白質為511個氨基酸殘基，是一種泛素連接酶，廣泛分布在腦、肺、肝、骨骼肌、腎臟等組織中，心、脾、睪丸也有少量表達。結構上由于N端獨特的TRAF-C結構能結合不同的蛋白分子，使TRAF6既參與CD40的信號轉導又參與IL-1R/TLRs的信號轉導[2,8]，是TRAFs家族中唯一一個可以直接和CD40、IRAK以及NF-κB受體激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)相結合的銜接蛋白，但所介導的結果似乎相似，皆可激活NF-κB[9,10]。在多種病理生理如先天免疫和適應性免疫，骨代謝和淋巴結的發展，乳腺/皮膚和中樞神經系統的形成等過程中發揮著重要作用。

2 TRAF6與破骨細胞

破骨細胞(osteoclast，OC)是來源于骨髓單核/巨噬細胞系經單核巨噬細胞系的前體細胞分化為具有抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)陽性的多核細胞，在骨營養激素和骨微環境產生的局部因子調節下，在骨吸收部位分化為破骨細胞，行使骨吸收的功能。現已證實，核因子κB受體激動劑(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)是破骨細胞分化與成熟過程中的重要因子，成骨細胞合成的NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand)與破骨前體細胞上的RANK的結合后，激活胞內信號轉導途徑，使破骨細胞分化加快，凋亡抑制，最終導致破骨細胞數量增多，骨吸收功能亢進。因此，RANKL/RANK通路也被認為是介導破骨細胞分化成熟的最重要的信號通路[11,12]。近年來的研究發現，TRAF6作為細胞內信號傳導的重要接頭蛋白在RANKL/RANK介導的破骨細胞分化與成熟過程中起著不可或缺的作用。

研究發現，RANK與RANKL結合后，促使RANK胞內區與TRAF分子C端相結合，而能與RANK結合的TRAF有TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TRAF6，且不同類型的TRAF與RANK不同的氨基酸位點結合[2]。Armstrong等[13]用敲除不同TRAF結合位點的突變將RANK cDNA的不同區域轉染至無RANK的造血祖細胞的方法，發現RANK的胞漿段含有多個TRAF結合區，其近膜端基序結合TRAF6，C端區域結合TRAFs 1、2、3、5。且TRAF6是維持破骨細胞骨架形成和骨吸收作用所必須，其作用不能由TRAF2和TRAF5替代。

Kadono等[14]發現RANK在胞內有3個TRAF6部位，且這三條通道均能獨自介導RANK信號途徑。Ye等[2]發現RANK與TRAF6的結合部位有一種Pro-X-Glu-X-X-芳香族/酸性殘基的序列，此序列在CD40和IL-1R的TRAF6的結合部位中也存在，而在其余TRAF蛋白中存在明顯差異，也許正是這種差異導致了TRAF6與相關結合膜蛋白如RNAK結合的特異性。

Kobayashi等[15]發現，將缺少環指結構的突變TRAF6蛋白分子導人TRAF-/-的小鼠破骨細胞前體細胞內，在M-CSF和RANKL的刺激下，前體細胞只能分化為抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)陽性的破骨細胞樣細胞(osteoclast-like cell，OCL)，而無法形成肌動蛋白環，即無法發揮骨吸收作用。用同樣的方法還發現，缺少第二和第三位鋅指結構的TRAF6蛋白，無法使破骨細胞前體細胞分化為OCL。

由此可見，RANK與TRAF6的結合是RANKL/RANK信號下傳的第一步，在破骨細胞的分化和成熟中每一個位點的結合都是十分重要的。TRAF6的C端與RANK結合后，誘導其位于N端募集胞漿內其它含有TRAF6的蛋白分子，使TRAF6三聚化，形成RANK-TRAF6-轉化生長因子β激活激酶1(TAK1)結合蛋白2(TAB2)-TAK1復合物，誘導TAK1活化[16]，進而激活NF-κB、c-Src以及促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)下傳RANKL/RANK信號發揮調節OC數量及活性的作用；另一方面某些因子也經TRAF6發揮作用，如TNF可經TRAF6促進OC生成，而白介素(IL-1)通過TRAF6抑制OC凋亡[17]。所以TRAF6在RANKL的細胞內信號轉導中起樞紐作用。

Lee等[18]發現，RANKL/RANK結合后首先以振蕩模式瞬時招募TRAF6綁定，隨后，TRAF6在RANKL刺激下以非振蕩模式與RANK相互作用。這表明RANK振蕩募集TRAF6可能介導了RANKL誘導的MAPK信號通路的激活。在M-CSF和RANKL的刺激下，TRAF6缺失(TRAF6-/-)的破骨細胞前體不能分化為破骨細胞，說明TRAF6在前體細胞向OC和巨噬細胞分化的分支點發揮重要作用。TRAF6-/-細胞中RANKL誘導的p38活化不明顯，而RANKL誘導的ERK和JNK活化以及M-CSF誘導的ERK、p38和JNK活化并不受影響；進一步研究發現，TRAF6-/-細胞中活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)和c-Fos的表達下調，NFATc1、c-Fos以及p65向核內轉運受阻。表明RANKL/RANK/TRAF6信號通路通過持續激活p38后可上調破骨細胞轉錄因子的和促進破骨細胞分化[19]。

Yen等[20]的研究發現，在腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的刺激下，人源單核細胞和小鼠RAW264.7細胞系p38 MAPK、JNK、ERK的磷酸化明顯增強，骨吸收活性明顯；但被TRAF6 siRNA轉染后，前體細胞只能分化為TRAP陽性的OCL，p38 MAPK、JNK、ERK磷酸化受抑制，NFATc1表達下調，骨吸收活性明顯降低，且在TRAF6-/-骨髓巨噬細胞，TRAIL誘導破骨細胞分化作用被完全抑制，表明TRAF6依賴的信號傳導不僅在TRAIL誘導破骨細胞分化作用中起主要作用，還參與破骨細胞活化，并可以通過TRAF6等除RANKL以外其它TNF超家族分子來調控RANK信號傳導。

Nakamura等[21]發現，前破骨細胞在IL-1刺激下，TRAF6可與c-Src作用形成TRAF6/c-Src分子復合物，使p130Cas、蛋白質酪氨酸激酶2、c-Src磷酸化，誘導其骨架重構分化為破骨細胞。c-Src缺如的OCL免疫共沉淀法將無法檢測到TRAF6復合物的形成，進而影響肌動蛋白環和胞膜的微皺褶形成障礙，使OCL無法正常黏附于骨表面并發揮骨吸收的作用。

腫瘤壞死因子受體相關因子聯合核因子-κB激酶(TRAF family member-associated NF-κB activator，TANK)可與TRAF6結合介導NF-κB通路負向調控破骨細胞的分化。研究發現，在RANKL誘導的破骨細胞前體細胞中，TANK mRNA 和蛋白均出現低表達。而體外TANK-/-小鼠出現明顯的骨小梁損失，骨皮質密度增加，進一步檢測發現胞內TRAF6泛素化上升，經典途徑NF-κB生成增多，破骨細胞的轉化明顯增加[22]。

TRAF6與RANK結合被泛素化后，形成RANK-TRAF6-轉化生長因子β激活激酶1(TAK1)結合蛋白2(TAB2)-TAK1復合物，最終激活NF-κB信號通路。NF-κB是破骨細胞分化所必需的細胞因子，有研究發現，NF-κB1/2雙基因敲除小鼠與RANKL/RANK雙基因敲除小鼠的破骨細胞分化障礙相似，它們的破骨前體細胞都停止在分化階段，不能夠表達破骨細胞分化的重要作用因子，如：TRAP、組織蛋白酶K、降鈣素受體等，使破骨前體細胞數量增加，但是凋亡沒有增加；且由于缺少破骨細胞導致的骨骼硬化癥[23]。由此可見，RANK與TRAF6的結合在破骨細胞形成的每一步中都是十分重要的。

3 TRAF6與成骨細胞

成骨細胞(osteoblast，OB)是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化。在骨形成過程中要經歷成骨細胞增殖，細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和成骨細胞凋亡4個階段。過去的幾年內，有關成骨細胞的分化、成熟調控的分子機制不斷被完善，如Wnt蛋白、骨形成蛋白(bone morphogenic protein，BMP)、成纖維生長因子、胰島素樣生長因子等，以及抑制成骨細胞分化增殖的細胞因子如腫瘤壞死因子等[24]。近年來研究發現，TRAF6參與TGFβ家族成員引起的TAK1-MAPKs的激活，在成骨細胞的分化成熟等方面起著重要作用[27]。

BMPs屬轉化生長因子-β超家族成員，是一組結構相關的多功能蛋白，在各種器官發生(包括骨和軟骨的形成)中起重要作用，其主要通過結合并激活細胞膜上特異性受體，通過Smads依賴性和Smads非依賴性兩種途徑傳遞信號，促進MSCs向OB分化。研究發現，TRAF6過表達降低Smad1蛋白穩定性抑制Smad1的表達，進而抑制成骨細胞的分化和骨礦化；而TRAF6-/-小鼠上調Smad1的表達，說明TRAF6可以通過BMP-Smad1通路調控OB的分化。進一步研究顯示，TRAF6不能促進OB的增殖，但是其通過Runx2和Osx的表達抑制成骨細胞的分化，且該抑制作用可以被Smad1逆轉，表明TRAF6與成骨細胞的分化關系密切，該作用通過Smad1介導，調節BMP通路抑制OB的分化[25,26]。

RUNX2是轉錄因子RUNXX家族成員之一，作為成骨細胞的特異轉錄因子，對骨組織的形成和重建起著重要作用。有研究發現，間充質前體細胞Runx2在TAK1-p38蛋白軸Smads非依賴性途徑的激活是必不可少，質子泵抑制劑蘭索拉唑可以與泛素C末端結合抑制去泛素酶CYLD活性進而增強TRAF6的多泛素化，上調RUNX2的表達，隨后RUNX2通過與成骨細胞特異性順式作用元件2(OSE2)相結合刺激堿性磷酸酶(ALP)的表達，從而間接刺激間充質干細胞向OB分化[28]。

目前相關研究主要集中在破骨細胞，有限的研究尚不能確定TRAF6表達與成骨細胞之間的聯系，進一步深入研究兩者之間的關系，也許在骨代謝性疾病的防治方面可開辟一條可行的新途徑。

4 TRAF6與骨代謝性疾病

Lomaga等[29]發現4周齡TRAF6-/-小鼠表現為嚴重骨骼硬化癥如長骨特別是股骨長度變短、基底部變寬，扁骨的骨骼結構和形態顯示正常，X平片提示骨密度增加以及沒有門牙和臼齒等牙齒萌出缺陷表現。

李霞等[30]選用TRAF6-/-的大鼠，發現牙胚發育過程中TRAF6呈動態時空表達模式：從牙板開始增厚時牙板上皮細胞就表達TRAF6，尤其鐘狀早期內釉細胞及鐘狀晚期(硬組織形成期)成釉上皮細胞質TRAF6強陽性表達；牙乳頭間充質細胞及成牙本質細胞在鐘狀早期時TRAF6呈陽性表達，至硬組織形成期成牙本質細胞質強陽性表達TRAF6，而牙乳頭間充質細胞變為弱陽性表達，至出生后7d時未見表達。表明TRAF6可能在牙胚細胞增殖、分化和發育中發揮重要作用。

Zhu等[31,32]研究發現，RA患者滑膜組織TRAF6表達與血清骨代謝標志物I型前膠原氨基端前肽(PINP)、骨鈣素降解產物(N-MID.OC)呈正相關(r=0.381，0.345，P<0.05)。提示滑膜TRAF6表達增加可能與RA代償性骨形成增加有關，TRAF6可能通過介導滑膜炎癥參與了RA的骨代謝失衡。具體機制可能與TRAF6在破骨細胞膜與RANK結合并激發了TRAF6的募集并進一步激活NF-κB和NFATcl促使破骨細胞的形成有關。

Liu等[36]通過培養人關節軟骨細胞(從骨關節炎患者收獲)，用IL-1β刺激的軟骨細胞TLR4和下游的信號分子MyD88和TRAF6顯著上調，以及由此刺激TNFα的合成和NF-κB的活化均有明顯增加。表明TRAF6可能在骨關節炎患者軟骨病變過程中發揮重要作用。

p62/SQSTM1是一個由SQSTM1編碼的多功能泛素結合蛋白，其一級結構序列中有一個可以與TRAF6結合的結構域[33]。有研究發現，在RANK誘導信號中，p62蛋白通過與TRAF6聚集形成p62-TRAF6信號復合物，與非典型蛋白激酶C(aPKC)蛋白相互作用，通過NF-κB抑制物的激酶(IKKb)的磷酸化，調節NF-κB的活化，促進破骨細胞的形成及活化，在骨代謝的調節及骨質疏松的形成中發揮重要的作用[34]。SQSTM1基因突變是在Paget骨病患者中檢出率最高的基因突變，有研究發現，p62蛋白的變異減弱了p62與TRAF6的結合能力，導致了NF-kB信號通路的增強以及增加了破骨祖細胞對RANKL、TNF的敏感性[35]，因此調控TRAF6有可能成為研究和治療Paget骨病的一種方法和手段。

5 總結與展望

骨代謝是骨組織不斷進行改建活動的一個復雜過程，其中破骨細胞發揮吸收骨基質的功能，而成骨細胞起著合成骨基質的作用，二者相輔相成，缺一不可。隨著骨免疫學的發展，研究破骨細胞/成骨細胞的分化成熟與免疫炙手可熱。TRAF6是近年來在骨代謝及骨免疫中起重要調節作用的接頭蛋白，其不僅參與CD40、IL-1R/TLRs信號轉導激活的NF-κB和JNK信號通路調控DCs細胞、B細胞的成熟、增殖和分化，還介導RANKL/RANK通路直接或間接作用于骨分化，特別是對破骨細胞的分化、成熟、活化等各個方面都有影響，研究亦較多和成熟，而有關成骨細胞相關研究有待進一步開展，以期為骨質疏松、骨關節炎等疾病的治療開拓新的思路。