TLRs及轉導基因在奶牛乳房炎防控中的研究進展

武 瑩，謝燕紅，鞠德才

(1.江蘇省泰州市華威特(江蘇)生物制藥有限公司，江蘇泰州 225300； 2.福建省三明市新陽鎮畜牧獸醫水產站)

專題論述

TLRs及轉導基因在奶牛乳房炎防控中的研究進展

武 瑩1，謝燕紅2，鞠德才1

(1.江蘇省泰州市華威特(江蘇)生物制藥有限公司，江蘇泰州 225300； 2.福建省三明市新陽鎮畜牧獸醫水產站)

奶牛乳房炎防控是目前世界范圍內仍未完全解決的頑疾之一。奶牛一旦發生乳房炎感染后一般多采用抗生素治療，不僅可引起奶牛產奶量下降甚至停奶，且有可能導致牛奶中抗生素殘留，危害人體健康。TLRs(Toll-like receptors)則能識別病原體的相關分子模式(PAMP)，在天然免疫防御病原體中起著重要作用。TLR4是TLRs家族成員之一，能識別革蘭氏陰性菌細胞壁成分中的脂多糖(LPS)和脂磷壁酸，通過信號轉導，誘導促炎癥因子等基因的表達，使機體產生抗病性。

奶牛乳房炎在給奶牛生產帶來巨大經濟損失的同時，還嚴重威脅著人體健康。據金忠明等(2009)[1]報道，目前世界范圍內約有三分之一的奶牛患有不同類型的乳房炎。奶牛乳房炎的主要致病因素是病原微生物感染，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌最為常見[2]。奶牛乳房炎是嚴重危害奶牛業生產發展的常見疫病之一，是奶業生產者和科研工作者所關注的熱點問題之一。

1 奶牛乳房炎的致病機理研究進展

奶牛乳腺組織因其解剖學上的特殊性而容易受到病原微生物的入侵而發生炎癥，炎癥的發生主要經微生物入侵、乳腺組織內建立感染、引起乳腺炎癥乃至全身出現臨床癥狀的一系列過程。

病原菌黏附到乳腺上皮細胞是感染過程的早期事件，黏附過程主要受細菌表面結構和乳汁與乳腺中的宿主因子調節。乳房炎病原菌利用宿主因子，如細胞外基質蛋白、蛋白聚糖和乳蛋白增加其黏附于奶牛乳腺上皮細胞的能力，通過與乳汁中可溶性宿主因子結合進而結合到乳腺上皮細胞。這種“分子橋梁”被病原菌用來活化宿主細胞，即乳腺上皮細胞表面某些特異受體并誘導一系列級聯反應，從而使病原菌進入宿主細胞而引發疫病[3-4]。

2000年，Hebert等(2000)[5]首次在慢性感染乳房炎的奶牛乳汁巨噬細胞和腺泡細胞中發現存活的金黃色葡萄球菌，證實金黃色葡萄球菌能侵入腺泡細胞和巨噬細胞。研究發現金黃色葡萄球菌能成功侵入和定居于乳腺上皮細胞并引起宿主細胞的凋亡，是乳汁中白細胞并不能提供有效防衛及金黃色葡萄球菌引起的乳房炎很難防控的重要原因之一。

2 TLRs研究進展

TLR家族成員的結構以細胞外的亮氨酸重復序列(LRR)和細胞內的TIR結構域(TIR)為主要特征，前者主要行使識別配體，以及與其他復合受體結合形成受體復合物，再識別相應的配體；而后者與IL-R1胞質區的結構域同源，故稱之為Toll-IL-1受體結構域或TIR結構域，具有嗜同性相互作用，藉此來募集下游含有TIR的信號分子，組成信號復合體[6-7]。

TLRs的組織細胞分布十分廣泛，在DC、單核細胞、巨噬細胞和B細胞、上皮細胞、肥大細胞以及成纖維細胞中均有存在，而且每種細胞所表達的TLR種類有所不同，不同的TLR在不同的組織和細胞中表達量也有所不同。TLR1主要在單核細胞、中性粒細胞、B細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)上表達；TLR2則在單核細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞中大量表達；TLR3只表達在樹突狀細胞上；TLR4則主要表達在內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞上；TLR5主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞上。除TLR3以外的其余TLRs在單核細胞和巨噬細胞中均有表達。此外，TLRs在內皮細胞，脂肪細胞，心肌細胞，腸上皮細胞等其他細胞中也有存在[8-10]。

2.1 TLRs的信號轉導通路 哺乳動物TLRs信號轉導與果蠅相比，果蠅的Toll-和IMD-途徑分別在抗真菌和抗革蘭氏陰性菌上是必不可少的，而哺乳動物抗微生物主要依賴的是TLRs的TIR結構域的信號通路。TLRs家族信號通路與IL-1R家族的信號通路則非常相似，都與連接蛋白MyD88相互作用，MyD88在C-端有一個TIR結構域，可以與TLR的TIR結構域相結合，而在N-端有一個TLR能識別的跨膜死亡結構域。通過死亡結構域可與下游的信號分子相結合，即在刺激過程中，MyD88就會吸附很多的死亡結構域——包括絲氨酸/蘇氨酸激酶，即IL-1R相關激酶(IRAKs)。IRAKs被磷酸化后，可激活TRAF6，從而截獲兩個不同的信號通路——JNK和NF-ΚB，活化NF-ΚB和AP21轉錄因子，誘導炎癥性細胞因子、黏附分子等多種基因表達，進而引起炎癥反應[11-12]。

一旦奶牛發生乳房炎感染后，大量繁殖的細菌及其代謝產物刺激乳腺組織，導致炎癥因子(如TLR4、TNF-A、IL-1等)表達量增加，激活NF-JB信號通路，使NF-JB表達增加，這一通路又能誘導炎性細胞因子和趨化因子的表達，啟動TNF-A、IL-1、細胞黏附分子和環氧合酶-2等基因轉錄，導致TNF-A、IL-1等促炎性因子大量產生，引發炎癥反應。并發乳房炎時，乳腺組織中NF-JB基因表達。Boulanger等(2003)[13]采用電泳遷移率變動分析法檢測牛奶中蛋白提取物NF-JB復合物活性，結果發現健康奶牛中未檢測到NF-JB復合物活性；臨床型乳房炎患牛中，則可檢測出高水平的NF-JB復合物活性；感染隱性乳房炎奶牛的乳汁細胞中NF-JB活性強度和IL-8及GM-CSF表達水平顯著相關，與SCC和中性白細胞所占比率則無相關性。與健康奶牛的乳汁細胞相比，感染乳房炎奶牛的乳汁細胞中IL-8和GM-CSF表達水平則有明顯增加。Boutet等(2007)[14]研究發現，催乳素(PRL)能通過NF-JB激活促進牛乳房上皮細胞的炎癥反應，經劑量依賴性分析，PRL能顯著提高IL-1B、IL-6、IL-8、GMCSF、TNF-A的表達量，則可間接證明發生乳房炎時，NF-JB在乳腺組織中發揮著重要作用。

2.2 TLRs的信號轉導分子 據O′Neill LA等(2002)[15]研究，IL-1R和TLRs的信號通路下游信號分子基本相同，包括連接蛋白MyD88，IL-1R相關蛋白酶(IRAKs)，轉化生長因子(TGF)，β活化激酶(TAK1)，TAK1結合蛋白1(TAB1)，TAK1結合蛋白2(TAB2)，腫瘤壞死因子相關因子6(TRAF6)，TLR4 能夠激活 MyD88 依賴的信號途徑，也能被 IL-1、IL-18 和其它 TLR 家族成員的配體激活，TLR4 還能激活 MyD88非依賴的信號途徑。

3 展望與應用

據研究報道，目前已有10個TLRs成員被發現，分別為TLR1-10，且已被全部定位。TLR1，TLR6和TLR10定位在6號染色體上，TLR7和TLR8定位在10號染色體上，TLR3和TLR5分別定位在27號和10號染色體上，TLR2和TLR4分別定位在17號染色體的近端和8號染色體的遠端，TLR9則定位在22號染色體上[16]。

2006年，Opsal等(2006)[17]克隆了TLR1、TLR6和TLR10基因長度，TLR1全長2743 bp，包含5個外顯子；TLR6全長2572 bp，包含3個外顯子；TLR10全長2497 bp，只有1個外顯子。TLR1，TLR6，TLR10這3個基因在染色體上的順序為：5′-TLR6-TLR1-TLR10-3′。

2006年，Menzies等(2006)[18]研究了牛、羊TLR1-10和人TLR1-10的同源性。結果發現牛、羊TLR1-10的同源性達95%以上，和人TLR1-10同源性達89%～90%。在牛TLRs的表達譜分析中發現，除TLR6外，其余的TLRs均在皮膚中表達，其中TLR2和TLR7的表達量最高，TLR4的表達量較低。

乳房炎是奶牛生產中的一種常見病，不同品種其發病率不同，因為在很大程度上與個體的遺傳因素有關。因此，在奶牛的遺傳育種工作中，選取對疾病抗性較好的牛只通過TLR4基因測序，則有可能得到具有優良抗性的編碼關鍵。

近年來，雖然對奶牛的乳房炎抗性相關基因研究方面已經取得了一定進展，但仍有其它具有較大效應的新基因有待研究發現，TLRs的研究成果就是其中一例。

[1]金忠明,徐敏華,高雪群,等. 奶牛乳房炎非抗生素療法[J]. 中國獸醫雜志,2009,02:81-82.

[2] 富艷玲,劉愛玲,李旭東. 奶牛乳房炎防治技術研究進展[J]. 中國獸藥雜志,2010,07:51-54.

[3] Almeida RA, Oliver SP. Interaction of coagulase-negative Staphylococcus species with bovine mammary epithelial cells[J]. Microbial Pathogenesis, 2001,31(5):205-212.

[4] Almeida RA, Luther DA, Oliver SP. Incubation of Streptococcus uberi with extracellular matrix proteins enhances adherence to and internalization into bovine mammary epithelial cells[J]. FEMS Microbio. Lett, 1999a, 178:81-85.

[5] Hebert A, Khampoune S, Senechal S, et al. Demonstration of intercellular Staphylococcus aureus in bovine mastitis alveolar cells and macrophages isolated from naturally infected cow milk[J]. FEMS Microbiol Lett, 2000, 193:57-62.

[6] Bradley AJ.Bovine mastitis:an evolving disease[J].The Veterinary Journal, 2002,164:116-128.

[7] Terry K. Matthew J, Douglas Tet al. Structure and function of Toll-like receptor proteins[J]. Life Sciences, 2000, 68:241-258.

[8] 李志杰,劉靖華,姜勇.Toll樣受體的發現及其研究進展[J].中國危重病急救醫學,2003,15(2):694-696.

[9] Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, et al. Differential expression and regulation of Toll-like receptors(TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells[J]. J Immunol,2000,164:5998-6004.

[10] Shizuo A, Kiyoshi T, Tsuneyasu K. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity [J]. Nat Immunol, 2001, 2:675-680.

[11] Takeda K, Kaisho T, Akira S.Toll-Like Receptors[J]. Annu Rev Immunol, 2003, 21: 335-376.

[12] Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical prteins linking innate and acquired immunity[J]. Nat Immunol, 2001, 2(8):675-680.

[13] Boulanger D,Bureau F,et al.Increased nuclear factor-JB activityin milk cells of mastitis affected cows[J].J Dairy Sci,2003,86:1259-1267.

[14] Boutet P J,Sulon R,Closset,et al.Prolactin-induced activation of nuclear factor-JB in bovine mammary epithelial cells: Role in chronic mastitis[J].J Dairy Sci,2007,90:155-164.

[15] O′Neill L A. Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily[J]. Curr Top Microbiol Immunol,2002,270:47-61.

[16] McGuire K, Jones M, Werling D, et al. Radiation hybrid mapping of all 10 characterized bovineToll-like receptors[J]. Animal Genetics, 2006, 37(1):47-50.

[17] Opsal M A, Vage D I, Hayes B, et al. Genomic organization and transcript profiling of the bovine toll-like receptor gene cluster TLR6-TLR1-TLR10[J].Gene,2006,15(384):45-50.

[18] Menzies M, Ingham A. Identification and expression of Toll-like receptors 1-10 in selected bovine and ovine tissues[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2006, 109(1-2):23-30.

2016-11-26

S858.23

A

1005-7307(2017)02-0013-003