人類腎結石果蠅模型的新進展

戴平 王固新 張東方

人類腎結石果蠅模型的新進展

戴平 王固新 張東方

泌尿系結石是泌尿外科的常見病、多發病，發病率達5%～15%［1］，其中腎結石又占泌尿系結石的40%～50%［2］。泌尿系結石引起的病理損害主要有直接損害、梗阻和感染，三者互為因果，促使病變發展，最終破壞腎組織，損害腎功能，甚至造成腎功能衰竭。因此，尿石癥是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發病。近幾十年里，由于人類臨床研究與動物模型的限制，國內外泌尿系結石的治療與預防措施的發展受到限制。近幾年，簡單而典型的果蠅作為一種新興且強大的人類疾病轉化模型出現在不同領域，其中也包括腎結石模型，其可能在泌尿系結石形成的方面能提供至關重要的信息［3］。

1 腎結石模型的建立

隨著對泌尿系結石研究的深入，各種利用實驗動物的體內和體外尿石模型也逐漸發展，并在這些年有新的突破。結石實驗模型不但可以深入了解泌尿系結石的形成過程和機制，且可以篩選抗尿路結石的藥物，確認其藥理作用和機制。因此，設計和建立尿路結石的動物及體外模型，無疑為探討尿路結石的發病機制、尋找有效防治尿路結石的藥物奠定良好的基礎。目前已知的建模方法有通過乙二醇法建立的大鼠等小型哺乳動物結石模型［4］；通過異物植入法建立的豬等大型哺乳動物及目前最新的通過遺傳和環境改變誘發的果蠅結石模型。

1.1 大鼠模型 大鼠模型通過乙二醇法建立，乙二醇法是目前較成熟的方法，成石液多為乙二醇與氯化氨。乙二醇為草酸代謝通路的中間產物，亦是草酸的前體，進入體內后轉化成羥乙酸，后者既可在羥乙酸氧化酶的作用下直接轉化為草酸，也可通過乳酸脫氧酶的催化轉化為乙醛酸，乙醛酸又可直接在非酶作用下轉化為草酸。因此，攝入乙二醇可導致動物體內草酸增加而形成草酸鈣。在有腎結石的人類和大鼠腎乳頭表面均能發現草酸鈣或磷酸鈣的有機晶體。高草酸尿癥能引起人類和大鼠的草酸鈣結石。飲食因素在腎結石的形成過程中起著重要作用［5-6］。人類和大鼠的草酸代謝幾乎是相同的。因此，在誘發人類和大鼠腎結石形成的實驗中有較多的相似性。因此大鼠草酸鈣腎結石模型可以用于研究人類腎結石形成的機制［7-8］。大鼠模型的優勢在于結石形成率高，飼養方便和解剖結構明確。然而，實驗性大鼠的繁殖和飼養費用在逐年增加，對大鼠進行遺傳操作的成本較高，且伴隨著一些技術性的困難。此外，大鼠模型的使用還出現一些其他問題，包括正常動物的異位鈣化會存在天然抑制劑及結石形成與溶解的代謝途徑調控基因存在未知的啟動子［9］。

1.2 豬模型 豬模型通過異物植入法建立，異物植入法是通過微創或開放手術直接將結石或誘發結石的異物放入豬等大型哺乳動物的腎盂或膀胱內。

1.3 果蠅模型 果蠅模型通過改變遺傳與環境條件方法建立。果蠅的馬氏管（Malpighian tubules）在功能上與人類腎小管相似，馬氏管也是溶質轉運及排泄鈣、磷、尿酸等離子的場所［10］。昆蟲學家發現馬氏管內的離子沉積凝固物，認為馬氏管是果蠅溶質沉積的場所［11］。國外團隊應用先進的同步輻射技術發現馬氏管內的凝固物與人類腎結石形成時的異味鈣化板塊具有相同特征［12］。果蠅結石模型提供了一個獨特的機會了解泌尿系結石具體發生機制，是可操作性強與可量化的成石方式［3］。

由于泌尿系結石的發病機制至今尚未明確，一直阻礙著對其預防和治療措施的發展。人體臨床研究和泌尿系結石動物模型一直受到成本、道德標準及較長的成石周期的約束。此外，這些哺乳動物模型遺傳和生理的復雜性掩蓋了實驗過程中飲食操作、環境改變、遺傳變異對結石形成基本過程的真正影響。

2 果蠅模型的應用

草酸鈣模型的建立是研究腎結石的基礎。Chen等［9］在果蠅培養基中加入各種濃度的草酸前體物質：乙二醇、草酸鈉、羥脯氨酸，經過一段時間后解剖并分離果蠅馬氏管可見一水草酸鈣與二水草酸鈣結晶，分析結石成分主要為草酸鈣結石，同時加入枸櫞酸鉀飼養可發現果蠅結石形成明顯減少，壽命明顯延長。該實驗在一定程度上表明果蠅可能具有與哺乳動物相似的內外源性草酸代謝途徑。

果蠅模型在一些腎結石的基礎研究中也有新的發展，其中比較突出的是異位鈣化，通過研究異位鈣化的起始因素，進而對腎結石的發生、發展有重要意義。目前有研究［13］證明抑制人或狗體內黃嘌呤脫氫酶可致腎結石的發生。Chi［3］通過抑制黃嘌呤脫氫酶基因的表達建立果蠅結石模型，并分析結石成分發現果蠅馬氏管中出現鋅離子高度濃縮現象，這種現象同樣也出現在人類腎結石和蘭達爾斑塊中。為了進一步研究鋅離子在異位鈣化中的作用，抑制果蠅的鋅離子轉運體基因表達，從而發現果蠅馬氏管中的結石形成受到明顯抑制。此外，還通過飲食、藥物等多種途徑降低鋅離子的攝入，并證實鋅離子在異位鈣化中起十分重要的作用，這些對明確腎結石的發病機制和制定預防措施有重要意義。

眾所周知硫酸鹽特別是硫代硫酸鹽是氰化物中毒的解毒劑也可用于降低鉑化物對腎臟的損害。因硫代硫酸根離子與Slc26a6的親和力比草酸根高，較多實驗團隊從硫代硫酸鹽研究防治草酸鈣結石。Landry［14］應用非洲爪蟾蜍卵細胞，通過電生理學實驗證明硫代硫酸根離子與Slc26a6的親和力高于草酸根，并用敲除了草酸轉運體基因的果蠅模型，在果蠅培養基中同時加入乙二醇和硫代硫酸鈉/硫酸鹽，發現果蠅馬氏管中的草酸鈣結石顯著減少，從而證實硫代硫酸根離子通過競爭性結合草酸轉運體蛋白拮抗草酸根離子與受體結合，進而減少草酸的分泌和吸收，抑制草酸鈣結石的形成。上述研究成功應用果蠅結石模型，為臨床應用硫代硫酸鹽防治腎結石提供了理論基礎和依據。

3 小結

果蠅模型已經成功應用于人類多種疾病及多器官、多系統的研究。但果蠅也有著局限性，其腎臟系統在解剖結構上是分離的且無腎小球樣結構，其尿液產生也不是超濾的，而是通過主動分泌水、電解質形成，且對尿液的重吸收功能也不是馬氏管而是與其相連的胃腸系統［12，15］。此外，因果蠅體積較小，目前尚無收集并監測果蠅血液、尿液成分的有效方法，這就導致無法確定果蠅是否出現高草酸尿、酸中毒或高草酸血癥等，這可能使分析結果出現錯誤，例如乙二醇處理的果蠅無法確定其壽命縮短的主要原因是酸中毒還是草酸鈣，枸櫞酸鉀處理的果蠅壽命延長的主要原因是枸櫞酸鉀螯合鈣離子還是鉀離子濃度升高抑制鈣離子分泌從而使草酸鈣結石形成減少，亦或是枸櫞酸鉀中和減輕了由乙二醇引起的酸中毒［12，15］。當然，果蠅的優勢也是不容忽視的，這種多用途的動物已經成為一個具有已知實用數據和明確功能優勢的人類腎結石翻譯模型。低成本獲取、簡短的生命周期這些優點均有利用快速且低成本建模。果蠅的基因組是高度保守且極具特色，易通過一系列行之有效的和復雜的基因組工作操作。果蠅的突變株系也容易得到及培育。當然，最重要的還是果蠅馬氏管的基因活動、解剖結構、生理功能與人類腎小管非常相似。此外，這個模型的直觀性及允許簡單地定量操作實驗條件是其他模型所不及的?？傊祟惸I結石果蠅模型既有明顯優勢又有無法避免的劣勢，如何充分利用果蠅模型開展針對腎結石發生、發展過程及其防治的研究工作將是未來重要的課題。

［1］ 周向文,黃冬梅．泌尿系結石的治療進展．中國誤診學雜志,2010,27(15):129-132．

［2］ 鐘文．腎下盞結石的微創外科治療．國際泌尿系統雜志,2005,25(5):621-624．

［3］ Chi T． A Drosophila model identifies a critical role for zinc in mineralization for kidney stone disease．Plos One,2015．10(5)．

［4］ 楊立軍,劉國華,朱江,等,腎結石動物模型的建立．腹腔鏡外科雜志,2013(10):785-787．

［5］ Muldowney FP． Prevention of recurrent stones in idiopathic hypercalciuria．New England Journal of Medicine,2002,346(21): 1667-1669．

［6］ Curhan GC,Willett WC,Speizer FE,et al．Comparison of dietary calcium with supplemental calcium and other nutrients as factors affecting the risk for kidney stones in women．Annals of Internal Medicine,1997,126(126):497-504．

［7］ Khan SR．Animal models of kidney stone formation:an analysis．World Journal of Urology,1997,15(4):236-243．

［8］ Evan AP,Bledsoe SB,Smith SB et al． Calcium oxalate crystal localization and osteopontin immunostaining in genetic hypercalciuric stone-forming rats．Kidney International,2004,65(1): 154-161．

［9］ Chen YH,Liu HP,Chen HY,et al．Ethylene glycol induces calcium oxalate crystal deposition in Malpighian tubules:a Drosophila model for nephrolithiasis/urolithiasis．Journal of Urology,2011, 80(187): 1299-1300．

［10］ Dow J, Romero MF．Drosophila provides rapid modeling of renal development,function,and disease．American Journal of Physiology Renal Physiology,2010,299(6):1237-1244．

［11］ Wessing A,Zierold K,Hevert F．Two types of concretions in Drosophila Malpighian tubules as revealed by x-ray microanalysis:a study on urine formation．Journal of Insect Physiology,1992, 38:543-554．

［12］ Miller J,Chi T,Kapahi P,et al．Drosophila Melanogaster as an Emerging Translational Model of Human Nephrolithiasis．Journal of Urology, 2013,190(5):1648-1656．

［13］ Jacinto AM,Mellanby RJ,Chandler M,et al．Urine concentrations of xanthine,hypoxanthine and uric acid in UK Cavalier King Charles spaniels．Journal of Small Animal Practice,2013,54(8):395-398．

［14］ Landry GM．Sulfate and thiosulfate inhibit oxalate transport via a dPrestin(mSlc26a6)-dependent mechanism in an insect model of calcium oxalate nephrolithiasis．Ajp Renal Physiolo gy,2015,310(2):7968-7793．

［15］ Knauf F,Preisig PA．Drosophila:a fruitful model for calcium oxalate nephrolithiasis? Kidney International,2011,80(4):327-329．

518000 廣東醫科大學附屬福田區人民醫院