非病毒基因載體的研究進展

吳廣升 惠光艷

非病毒基因載體的研究進展

吳廣升 惠光艷

病毒載體與非病毒載體是目前最常使用的兩大類基因轉運載體。雖然病毒載體，如腺病毒、慢病毒等轉染效率更高，但由于存在細胞毒性、潛在致突變性及較高的免疫原性等的安全問題，使其在臨床進一步應用受到很大的限制。非病毒載體，如天然多糖聚合物、陽離子聚合物、脂質體、無機納米載體等具有結構簡單、制備過程可控、低免疫原性等優(yōu)點。本文主要就非病毒基因載體的研究進展進行綜述。

基因；載體；綜述

基因治療是將基因(質粒DNA，siRNA及miRNA等)轉染入特定細胞中，通過促進或抑制目的蛋白質的表達，從而達到治療人類疾病的目的[1]。由于RNA及DNA基因片段自身帶負電荷且易被核酸酶降解、很難穿過帶負電荷的細胞膜，選擇適當的基因載體保護并轉運基因片段進入到細胞內是急需解決的問題[2]。病毒載體與非病毒載體是最常使用的兩大類基因轉運載體。病毒載體雖然轉染效率高，但免疫原性、致瘤性及難以大量制備等缺點限制了其臨床應用。天然多糖聚合物、陽離子聚合物、脂質體等非病毒載體具有結構簡單、免疫原性弱等優(yōu)點，是一類非常有應用前景的基因載體。

1 天然多糖聚合物

目前天然多糖基因載體以殼聚糖、葡聚糖、環(huán)糊精、甘露聚糖、透明質酸等最為常見。多糖由多個重復的單元、基團構成，并決定了其溶解度、表面電荷及化學修飾的難易度等特性，并最終影響轉染效率[3]。

1.1 殼聚糖 殼聚糖是甲殼素脫乙酰而形成的天然生物大分子，具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性，可以與帶負電荷的DNA、siRNA及miRNA等通過靜電吸引方式結合形成納米聚合物。不僅可以保護這些基因免受核酸酶的降解，還有利于細胞對其黏附、吞噬。Wu等[4]以殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質酸(CS/TPP/HA)納米粒為載體，觀察此納米粒的粒徑、電位、多分散性及對antimiR-138的包封率等指標，發(fā)現CS/TPP/HA納米粒不僅可以負載antimiR-138、保護其活性不受RNA酶降解，還可以將antimiR-138成功地轉染入大鼠骨髓來源的間充質干細胞(MSCs)中，促進成骨相關基因和蛋白的表達。Chen等制備了CS/TPP/miR-199a-5p納米粒并轉染人骨髓來源的MSCs，可以提高MSCs的ALP水平、細胞基質礦化及成骨相關基因的表達，將CS/TPP/miR-199a-5p納米粒轉染體系用于大鼠脛骨缺損處，可以顯著提高骨再生的量[5]。

1.2 葡聚糖 葡聚糖，也被稱右旋糖酐，由多個重復葡萄糖單元構成多糖聚合物，具有良好的生物相容性。葡聚糖眾多的羥基基團結構易于化學修飾，已經被廣泛應用于基因轉染和治療的研究。學者們經常對葡聚糖進行一定的改性，利用葡聚糖的衍生物載基因。Thomas等[6]利用縮水甘油基三甲基氯化銨改性葡聚糖并與小牛胸腺DNA(ctDNA)結合制備出納米粒，降低了DNA表面電荷和直徑；采用瓊脂糖凝膠電泳證實其穩(wěn)定性及保護DNA不被核酸酶消化。體外采用MTT法檢測葡聚糖基衍生納米粒對HepG2細胞的細胞毒性，證實其安全性及轉染細胞的可行性的。

1.3 環(huán)糊精 環(huán)糊精(Cyclodextrin)是一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6～12個D-吡喃葡萄糖單元，是環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶對直鏈淀粉進行酶解產生的。環(huán)糊精作為天然生物材料，無免疫原性，生物相容性好，引入修飾基對環(huán)糊精的理化性質進行改性，使其成為靶向的基因載體已成為廣大學者研究的重點方向之一[7]。用聚乙烯亞胺(PEI)修飾環(huán)糊精可顯著提高轉染效率。Hu等[8]將低分子量的PEI連接到環(huán)糊精骨架上負載miRNA-34a，發(fā)現較單純的環(huán)糊精，環(huán)糊精-PEI載體顯示出更高的轉染效率，胰腺癌細胞被環(huán)糊精-PEI/miRNA-34a納米粒轉染后其增殖、遷移能力顯著降低。

1.4 甘露聚糖 甘露聚糖是以甘露糖為單體的高度分枝聚合物，廣泛存在于多種生命形式中。其可來源于魔芋、蘆薈、海藻、酵母等天然產物。Ruan等[9]將精胺連接到甘露聚糖的側鏈上，接枝率約12%，然后此甘露聚糖-精胺負載DNA并轉染甘露糖受體高表達的巨噬細胞，發(fā)現轉染效率為精胺普魯蘭多糖的28.5倍，PEI的11.5倍及脂質體2 000的3.0倍。證明該甘露聚糖-精胺轉染體系是一個通過巨噬細胞甘露糖受體介導的穩(wěn)定的特異性轉染系統(tǒng)。

2 脂質體轉染體系

在體外，脂質體是最常用的基因轉染試劑之一。陽離子脂質體表面帶正電荷，可與帶負電荷的siRNA、miRNA等核酸結合，通過包裹核酸，保護其免受血液中核酸酶的降解，并維持其完整性和生物活性。然而，由于脂質體較高的毒性，非特異性細胞攝取和不必要的免疫反應等缺點，很難在體內實現安全、有效地應用[10]。陽離子脂質體/核酸復合物表面帶正電荷，可與帶負電荷的細胞膜通過靜電吸附作用結合，再通過細胞膜融合將核酸導入細胞核。目前，常用的幾個商業(yè)化脂質體包括RNAifect Transfection(Qiagen)，PORT NeoFX(Applied Biosystems)，Lipofectamine(Invitrogen)等品牌。許多學者一直致力于改變脂質體結構及應用方式，并取得了一些成功[11]。Wu等[12]將Lipofectamine2000/antimiR-138復合物通過冷凍干燥的方法固定到細胞培養(yǎng)板(TCPS)的表面，發(fā)現此脂質體/antimiR-138復合體可以以一種完整的近圓球形顆粒的結構附著在培養(yǎng)板表面，可以長期保持miRNA的穩(wěn)定性及生物學功能。之后作者又將MSCs接種于該脂質體/miRNA涂層表面，證實其可以促進MSCs成骨相關基因的表達，較傳統(tǒng)轉染方法具有更低的細胞毒性和更高的轉染效率。

3 聚乳酸聚乙醇酸Poly(lactide-co-glycolide)(PLGA)

PLGA聚合物是一類不溶于水的高分子有機聚合物，具有良好的生物相容性、低毒性及低免疫原性等優(yōu)點[13]。之前很多研究主要關注PLGA聚合物負載miRNA效率及非特異轉染進入細胞的過程，近期研究表明PLGA還具有控釋miRNA特點[14]。陽離子聚合物(如PEI、殼聚糖)對PLGA修飾可以穩(wěn)定其表面Zeta電位，增大miRNAs吸附效率[13]。PLGA聚合物可以很容易地接枝其他活性分子并形成微粒和納米顆粒[15]。PLGA納米粒負載DNA、miRNA、siRNA等核苷酸時，載藥能力高并可以對抗核酸降解。

4 聚乙烯亞胺(Polyethylenei-mine，PEI)

PEI是一種廣泛研究的聚合物基因載體，合成方便、價格低廉。在生理環(huán)境中，由于胺基質子化使其帶正電荷，可以和核酸結合形成聚合物。PEI和核酸酸形成的陽離子復合物通常保留的凈正電荷，可與細胞表面帶負電的糖蛋白和蛋白聚糖等發(fā)生非特異性結合。一旦該復合體與細胞表面結合，隨后經過內吞作用進入胞漿。PEI/核酸聚合體在胞漿內釋放的過程主要是通過一種所謂的“質子海綿”效應促進核酸釋放入細胞質。PEI的轉染效率很大程度依賴于自身的理化特性(如相對分子質量、分支程度及陽離子電荷密度)、核酸形成復合物的特性(如顆粒大小、界面電位)、具體實驗條件(如孵化時間、聚合物濃度)[16]。利用PEI作為載體，負載DNA和siRNA已經成功地在動物模型體內進行轉染。

5 無機納米載體

隨著生物納米技術在醫(yī)學上的廣泛應用，無機納米載體在基因非病毒轉運載體的應用也逐漸成為一個熱點研究領域。目前常使用的非病毒基因載體主要包括以下幾種：金屬納米顆粒，如納米金、磁性納米顆粒；無機非金屬納米顆粒，如二氧化硅、磷酸鈣、羥基磷灰石；生物降解性高分子納米顆粒，如聚乳酸微球、納米凝膠及生物顆粒，如蛋白質、糖蛋白等。這些納米顆粒載體具有低毒、無免疫原性、易于修飾、單分散粒子尺寸及在體內代謝時間長等優(yōu)點[13]。金納米粒具有多種優(yōu)秀的生物學性質，如易于對其進行表面功能化，負載基因能力強，細胞毒性低，轉染效率高等。Crew等[17]將antimiR-130b通過硫醇基耦合的金納米粒，制備出antimiR-130b/金納米粒。通過凝膠電泳實驗證實miRNA/金納米粒的表面穩(wěn)定性好，共聚焦顯微鏡顯示Cy5標記的miRNA/金納米粒被細胞內吞，轉染后細胞形態(tài)無明顯改變。

6 水凝膠載體

水凝膠是由多種天然或人工合成的親水性聚合物交聯(lián)或自組裝所形成，對基因、蛋白、抗腫瘤藥物等均具有一定的緩釋性，包封率高，加載藥物方便，非常適合作為miRNA等核酸的載體及儲藏庫，并可以持續(xù)釋放基因類藥物。Nguyen等[18]將siRNA/miRNA和MSCs包封在聚乙二醇水凝膠三維網絡中，觀察siRNA對MSCs分化的影響。siRNA/miRNA在水凝膠中可以持續(xù)釋放3～6 d并可以促進被包封的MSCs成骨方向分化。Ma等[19]觀察了以殼聚糖溫敏凝膠作為RNAi載體和儲藏庫對小鼠巨噬細胞RANK信號的沉默效果。發(fā)現殼聚糖溫敏凝膠可以在體外控釋Cy3標記的siRNA。殼聚糖溫敏凝膠負載RNAi并未顯示出明顯的細胞毒性，并且對細胞RANK信號的特異性沉默效果延長到9 d。

綜上所述，尋找和開發(fā)低毒高效的基因轉運載體是基因治療應用于臨床實踐的前提條件。如何在保持非病毒載體的安全性基礎上進一步提高其轉染效率，是非病毒載體研發(fā)中的熱點與難點。通過改性和修飾非病毒載體的基團，優(yōu)化其基因轉染能力是今后研究的一個重點方向。

[1]Rezaee M，Oskuee RK，Nassirli H，et al.Progress in the development of lipopolyplexes as efficient non-viral gene delivery systems[J].Journal of controlled release：official journal of the Controlled Release Society，2016，236(16)：1-14.

[2]Hacobian AR，Posa-Markaryan K，Sperger S，et al.Improved osteogenic vector for non-viral gene therapy[J].European cells&materials，2016，31(3)：191-204.

[3]蔣心馳，阮桂鑫，高建青.基于多糖聚合物的非病毒基因載體的研究進展[J].中國現代應用藥學，2015，32(2)：243-250.

[4]Wu G，Feng C，Hui G，et al.Improving the osteogenesis of rat mesenchymal stem cells by chitosan-based-microRNA nanoparticles[J].Carbohydr Polym，2016，138(3)：49-58.

[5]Chen X，Gu S，Chen BF，et al.Nanoparticle delivery of stable miR-199a-5p agomir improves the osteogenesis of human mesenchymal stem cells via the HIF1a pathway[J].Biomaterials，2015，53(3)：239-250.

[6]Thomas JJ，Rekha MR，Sharma CP.Dextran-glycidyltrimethylammonium chloride conjugate/DNA nanoplex：A potential non-viral and haemocompatible gene delivery system[J].International journal of pharmaceutics，2010，389(1-2)：195-206.

[7]Khuntawee W，Rungrotmongkol T，Wolschann P，et al.Conformation study of varepsilon-cyclodextrin：Replica exchange molecular dynamics simulations[J].Carbohydr Polym，2016，141(5)：99-105.

[8]Hu QL，Jiang QY，Jin X，et al.Cationic microRNA-delivering nanovectors with bifunctional peptides for efficient treatment of PANC-1 xenograft model[J].Biomaterials，2013，34(9)：2265-2276.

[9]Ruan GX，Chen YZ，Yao XL，et al.Macrophage mannose receptor-specific gene delivery vehicle for macrophage engineering[J].Acta Biomater，2014，10(5)：1847-1855.

[10]Lv H，Zhang S，Wang B，et al.Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery[J].Journal of controlled release，2006，114(1)：100-109.

[11]Xue HY，Guo P，Wen WC，et al.Lipid-Based Nanocarriers for RNA Delivery[J].Current pharmaceutical design，2015，21(22)：3140-3147.

[12]Wu K，Xu J，Liu M，et al.Induction of osteogenic differentiation of stem cells via a lyophilized microRNA reverse transfection formulation on a tissue culture plate[J].Int J Nanomedicine，2013(8)：1595-607.

[13]崔盼盼，陳超，趙娟娟，等.非病毒載體遞送微小RNA治療腫瘤的研究進展[J].遵義醫(yī)學院學報，2016，39(1)：92-97.

[14]Zhang Y，Wang Z，Gemeinhart RA.Progress in microRNA delivery[J].Journal of controlled release，2013，172(3)：962-974.

[15]Blum JS，Saltzman WM.High loading efficiency and tunable release of plasmid DNA encapsulated in submicron particles fabricated from PLGA conjugated with poly-L-lysine[J].Journal of controlled release，2008，129(1)：66-72.

[16]豐干鈞，劉立岷，龔全，等.聚乙烯亞胺為載體的體內核酸轉染研究進展[J].中國修復重建外科雜志，2014，28(12)：1544-1550.

[17]Crew E，Tessel MA，Rahman S，et al.MicroRNA conjugated gold nanoparticles and cell transfection[J].Analytical chemistry，2012，84(1)：26-29.

[18]Nguyen MK，Jeon O，Krebs MD，et al.Sustained localized presentation of RNA interfering molecules from in situ forming hydrogels to guide stem cell osteogenic differentiation[J].Biomaterials，2014，35(24)：6278-6286.

[19]Ma Z，Yang C，Song W，et al.Chitosan hydrogel as siRNA vector for prolonged gene silencing[J].Journal of nanobiotechnology，2014，12(23)：1477-1486.

Viral vectors and non-viral vectors are the two most commonly used gene delivery carriers at present.Although viral vectors，such as adenovirus and lentivirus have higher transfection efficiency，the security problems of cell toxicity and potential mutagenicity and high immunogenicity restrict them from further clinical application.Non-viral vectors，such as natural polysaccharide polymers，cationic polymers，liposomes and inorganic nano-carriers have the advantages of simple structure，controllable preparation process，low immunogenicity and so on.This article reviews the research progress of non-viral gene vectors.

Gene；Vector；Review

2016-09-08)

青島市市南區(qū)公共領域科技支撐計劃項目(2014-14-047-SW)

1005-619X(2017)02-0134-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.02.008

266071中國人民解放軍海軍青島第一療養(yǎng)院口腔科

惠光艷