帶熒光標記的新型丙型肝炎病毒感染性克隆的構建及其活性鑒定

陳晨 張永宏

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550001;2.貴州醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 貴陽 550001)

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△通信作者

帶熒光標記的新型丙型肝炎病毒感染性克隆的構建及其活性鑒定

陳晨1張永宏2△

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550001;2.貴州醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 貴陽 550001)

丙型肝炎病毒; 綠色熒光蛋白; mCherry; Huh7.5肝癌細胞; 感染

丙型肝炎病毒(HCV)屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬。研究[1]發現在HCV NS5A結構域Ⅲ中可插入大量異源序列如綠色熒光蛋白(EGFP)，從而對HCV感染的活細胞進行可視化研究。本次實驗將探索利用新型全長HCV感染性克隆(包括HCV基因2a型，同時構建HCV基因5a型嵌合體)，建立帶有報告基因EGFP、mCherry的HCV基因2a及5a型的活病毒，在完整HCV生命周期的水平上研究感染情況，為尋找HCV新藥物提供治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌細胞系Huh7.5細胞、質粒PJ6/JFH1-NS5Adel40EGFP(J6/JFH1-EGFP),PJ6/JFH1-NS5Adel40 mCherry(J6/JFH1-mCherry),YL21-2PSA135’UTR-NS2/JFH1(YL21),YL11 PJ65’UTR-NS2/JFH1(YL11)均為廣州中山大學病毒所提供。DMEM及新生牛血清購自美國 Gibco公司； T4-DNA 快速連接酶、NruI 內切酶購自美國NEB公司；SanDI、MreI等酶購自美國Fermentas公司；細胞轉染用脂質體Lipofectamine 購自美國Invitrogen公司；其他常用試劑為廣州中山大學實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 攜帶EGFP/mCherry報告基因質粒的構建 將目的基因J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry及載體YL21用SanDI和MreI雙酶切，回收攜帶報告基因EGFP或mCherry的片段，以T4 DNA快速連接酶連接，以空載體作對照。連接產物轉化至E.coli(Top10感受態),接種至LB(含氨芐AMP)平板，37 ℃孵箱過夜培養。

1.2.2 克隆鑒定及序列分析 挑取LB平板上生長的單個菌落至LB液體培養基，37 ℃，280 rpm,震搖培養16 h.取初篩陽性的菌株小量提取質粒，并用酶切以鑒定插入片斷。獲得新的帶有熒光蛋白的YP12pSA135’UTR-NS2/JFH1-NS5Adel40-EGFP(5a-EGFP)，YP13pSA135’UTR-NS2/JFH1-NS5Adel40-mCherry(5a-mCherry)。

1.2.3 質粒轉染 Huh7.5肝癌細胞株用DMEM培養基,在37 ℃，5%CO2條件下接種于6孔板，3.5×105/孔細胞數，培養約20 h,待形成約90%細胞單層后,用Lipofectamine試劑盒轉染J6/JFH1-EGFP,J6/JFH1-mCherry，5a-EGFP,5a-mCherry,YL11。操作過程按產品使用說明書進行。

1.2.4 EGFP/mCherry表達水平檢測及病毒滴度測定 轉染培養Huh7.5細胞在24 h、48 h、72 h、6 d、9 d、11 d、13 d直接在熒光顯微鏡下觀察熒光細胞。同時在上述時間點取含HCV病毒的轉染細胞培養上清液感染新的Huh7.5細胞，感染16 h更換DMEM培養基繼續培養,24 h后通過熒光顯微鏡觀察熒光細胞了解感染性病毒顆粒釋放情況，通過計數被感染細胞的熒光灶點形成單位(FFU/mL)計算細胞培養液的病毒滴度。具體測定方法參照文獻[2]報道進行。

2 結 果

2.1 陽性克隆酶切鑒定及序列測定 按照1.2.1設計進行酶切獲得含有報告基因的目的條帶。通過酶切鑒定克隆成功。并挑取陽性克隆進行序列分析，插入片段與模板DNA完全一樣。

2.2 Huh7.5細胞熒光蛋白檢測 如箭頭所示見圖1。

注:A1及A2，分別是J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry;B1 及B2，分別是5a-EGFP、5a-mCherry;表示上述各病毒用轉染細胞 的培養上清液感染新的細胞后的熒光檢測結果(熒光顯微鏡放大 倍數40倍)。圖1 重組HCV RNA 感染后細胞熒光檢測

2.3 病毒滴度測定 根據1.2.4的實驗結果在病毒轉染Huh7.5細胞后測定其不同培養天數的FFU值。見表1。

表1 帶有EGFP/mCherry的重組體滴度測定結果

3 討 論

本次實驗研究主體是分別帶有熒光蛋白標記的含EGFP或mCherry病毒。通過熒光蛋白作為熒光標記分子可以插入或是接合到目標基因并轉染到細胞中的方法，并運用熒光顯微鏡成像實時監測其活病毒轉染及感染到細胞的變化，被認為是一種極強的標記物。實驗研究對象是2a及5a嵌合體基因型的HCV病毒。利用J6-JFH1嵌合體病毒，將編碼熒光蛋白(GFP, RFP和VENUS-GFP)插入到NS5A區域，作為標記，即JC1/RFP,JC1/GFP,VENUS-JC1，JFH-EGFP。這些RNA在轉染Huh7細胞后，可產生活病毒[3]，表明NS5A結構域Ⅲ允許插入外源基因，而不會嚴重損害病毒的復制[4]。本實驗將帶有EGFP/mCherry的質粒(J6/JFH1-EGFP,J6/JFH1-mCherry)分別插入到質粒YL21中，成功的克隆出5a嵌合體5a-EGFP和5a-mCherry。并轉染到Huh7.5細胞中，熒光檢測細胞內可見EGFP/mCherry的表達，用其細胞培養上清液能感染新的Huh7.5細胞。通過對以上活病毒的收集，完成病毒滴度測定。

本研究成功致力于攜帶有報告基因的HCV克隆構建，同時鑒定該類克隆的病毒活性，這為不同地區、不同人群HCV感染的自然史、臨床檢驗、預后以及影響其轉歸的因素有哪些等一系列問題提供了新的指導思路。

[1] Appel N, Pietschmann T,Bartenschlager R.Mutational analysis of hepatitis C virus nonstructural protein 5A: potential role of differential phosphorylation in RNA replication and identification of a genetically flexible domain[J]. J Virol, 2005,79(5):3187-3194.

[2] Zhang J,Gastaminza P,Cheng G,et al.Robust hepatitis C vius infection in vitro[J].Proc Acad Sci USA,2005,102(26):9294-9299.

[3] Schaller T, Appel N, Koutsoudakis G,et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes[J]. J Virol, 2007,81(9):4591-4602.

[4] Gottwein JM,Jense TB,Mathiesen CK，et al. Development and Application of Hepatitis C Reporter Viruses with Genotype 1 to 7 Core-Nonstructural Protein 2 (NS2) Expressing Fluorescent Proteins or Luciferase in Modified JFH1 NS5A(2011)[J].J Virol,2011,85(17):4991-4996.

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