上皮間質轉化相關標志物在舌鱗癌組織中的表達及其臨床意義研究

朱名毅 姚金光 高潔△ 盧露碧 劉津

(1.右江民族醫學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000)

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上皮間質轉化相關標志物在舌鱗癌組織中的表達及其臨床意義研究

朱名毅1姚金光2高潔1△盧露碧1劉津2

(1.右江民族醫學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000)

目的 探討上皮間質轉化標志物鋅指E-盒結合同源異形盒-1(ZEB1)、E-鈣黏蛋白 (E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)在舌鱗癌組織中的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學Streptavidin-Peroxidase(SP)法檢測68例舌鱗癌組織、63例舌癌癌旁組織和68例正常舌上皮組織中ZEB1、E-cadherin、和N-cadherin的表達情況，并分析其表達與患者臨床病理特征及轉移的關系。結果 ZEB1、E-cadherin蛋白在舌鱗癌組織中的陽性表達率低于癌旁組織、正常上皮組織(P<0.05)；而N-cadherin蛋白在舌鱗癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織、正常上皮組織(P<0.05)。舌鱗癌組織中ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的陽性表達率在不同腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度及有無淋巴結轉移間比較差異有統計學意義 (P<0.05)。舌癌組織中ZEB1蛋白的陽性表達與E-cadherin蛋白陽性表達呈正相關；ZEB1蛋白的陽性表達與N-cadherin陽性蛋白表達呈負相關。結論 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin在舌鱗癌演變過程起重要的作用，可能參與了舌鱗癌侵襲和轉移的過程。

舌鱗癌； E-盒結合同源異形盒-1； E-鈣黏蛋白； N-鈣黏蛋白； 上皮間質轉化

舌鱗狀細胞癌是口腔頜面外科最常見的惡性腫瘤之一，其易通過淋巴管和血管發生轉移，手術難以徹底清除轉移的腫瘤細胞，而且轉移的細胞會抵抗后續的放療、化療等治療措施，從而引起腫瘤的復發[1]。有研究[2]報道上皮間質轉化(EMT)在腫瘤侵襲、轉移等過程中發揮重要的作用，但上皮間質轉化在舌磷癌轉移方面的研究還比較少。我們擬采用免疫組織化學SP檢測核轉錄因子ZEB1和EMT相關標志物(E-cadherin、N-cadherin)在正常舌黏膜鱗狀上皮組織、舌鱗癌組織及癌旁組織中的表達情況，并探討它們與舌鱗癌患者臨床病理因素之間的相關性，為闡明舌鱗癌浸潤轉移的分子機制及評價這些指標在舌鱗癌生物學中的作用提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 對象及標本來源 采用回顧性隊列研究，收集右江民族醫學院附屬醫院2010年1月至2013年9月手術切除的存檔舌鱗癌組織標本68例。所有病例術前均未經過化療、放療或其他治療措施，組織病理學證實均為鱗狀細胞癌。在68例癌標本中選取癌旁組織63例和正常舌鱗狀上皮組織68例(距離腫瘤邊緣5 cm以上)。

1.2 研究方法 手術切除的標本用4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，按4 μm厚度做石蠟標本切片，用SP法嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行免疫組化，然后在同等光源的條件下對標本免疫組化的結果在顯微鏡下拍照。陽性對照為已知的組織陽性切片，陰性對照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。鼠抗人ZEB1單克隆抗體購自美國sigma公司，E-cadherin和N-cadherin鼠抗人單克隆一抗、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶(SP)二抗試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化結果的評定 ZEB1蛋白主要表達于細胞核，E-cadherin和N-cadherin蛋白主要表達于細胞膜或細胞質，黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，著色明顯高于背景。結果評估采用半定量積分法，即根據每張切片的染色范圍和染色強度進行綜合評定。染色強度評分：棕褐色(強染色)，3分；黃色或淺棕色(中度染色)，2分；淺黃色(低度染色)，1分；無黃色(無染色)，0分。染色范圍評分：顯微鏡高倍視野下(×400)隨機每張切片選5個視野，按陽性細胞占同類細胞百分比計分，陽性細胞數>50%，3分；25%～50%，2分；5%～<25%，1分；<5%，0分。將兩個分值相乘做為每個病例的總積分，總積分>3分為陽性，總積分≤3分為陰性。陰性對照用PBS代替一抗。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0軟件對實驗數據進行統計學分析。實驗的計數資料采用卡方檢驗進行組間比較，采用Spearman等級相關分析進行計數資料的相關性分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達情況 舌鱗癌組中ZEB1和E-cadherin陽性表達率均低于癌旁組織組和正常舌組織組，三組間陽性表達率差異有統計學意義(P<0.05)；舌鱗癌組中N-cadherin陽性表達率高于癌旁組織組和正常舌組織組，三組間陽性表達率差異有統計學意(P<0.05)，見表1。

表1 E-cadherin、N-cadherin和ZEB1在舌癌相關組織中的陽性表達情況

2.2 舌鱗癌組織中ZEB1、E-cadherin和N-cadherin表達與臨床病理特征的關系 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的陽性表達在不同性別和腫瘤大小間差異均無統計學意義(P>0.05)；在不同腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移情況下，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin 在舌鱗癌組織中的陽性表達差異均有統計學意義(P<0.05)。這些結果表明ZEB1、E-cadherin 和N-cadherin蛋白表達高低可作為舌鱗癌惡性程度、轉移情況等臨床病理學特征的判斷標志物之一，見表2。

表2 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin表達與舌鱗癌患者臨床病理特征的關系

注：組間比較，*P<0.05。

2.3 舌鱗癌組織中ZEB1表達與E-cadherin和N-cadherin表達的相關性 68例舌癌組織中，ZEB1陽性18例，陰性50例。在18例ZEB1陽性的舌癌組織中E-cadherin陽性17例，兩者呈正相關(r=0.608，P=0.000)；在18例ZEB1陽性的舌癌組織中N-cadherin陽性3例，兩者呈負相關(r=-0.773，P=0.000)。而在50例N-cadherin陽性的舌癌組織中E-cadherin陽性13例，兩者呈負相關(r=-0.608，P=0.000)。

3 討 論

舌鱗癌的預后與腫瘤組織分化程度、TNM分期、腫瘤大小和淋巴結轉移等因素密切相關，其中腫瘤的病理分級和淋巴結轉移是影響和評價患者預后的最重要的因素[1]。但是舌鱗癌的轉移過程非常復雜，近年來開始從分子生物學的信號轉導和基因表達方面，對參與舌磷癌侵潤轉移的信號轉導途徑、核轉錄因子和細胞因子有一些初步的認識，但是，上皮間質轉化在舌磷癌轉移的作用機制還不是很清楚。近幾年發現上皮間質轉化是腫瘤侵襲和轉移中的關鍵環節，EMT是指上皮源細胞通過改變細胞形態、減少細胞間黏附等方式，轉變成為具有活動能力的間質細胞，從而獲得向周圍侵襲和遷移的能力。惡性腫瘤細胞發生EMT后，其侵襲和轉移的能力得到提高。EMT參與肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、肝癌等癌癥的原發性浸潤或繼發性轉移過程[3]。

上皮間質轉化轉錄因子ZEB1主要通過對E-鈣黏蛋白及N-鈣黏蛋白的調節作用，調節細胞間粘附作用從而促進腫瘤細胞的侵襲轉移能力，該機制己在多種腫瘤細胞中(胰腺癌、大腸癌及乳腺癌)所證實，轉染抑制細胞的ZEB1和ZEB2后，誘導N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達上調及E-鈣黏蛋白的表達下調[4]。E-鈣黏蛋白是鈣依賴性細胞間粘附分子，對建立和維持細胞間連接以及參與細胞間信號傳遞有重要作用。作為上皮細胞主要粘附分子，E-鈣黏蛋白正常表達時，上皮細胞間都保持良好的相互連接，腫瘤細胞很少發生轉移，但是E-鈣黏蛋白表達下調時則會引起腫瘤細胞從原發部位脫落[5]。N-鈣黏蛋白也是一種跨膜黏附分子，常表達于神經外胚層和中胚層來源的組織，正常上皮組織低表達。發生EMT的癌細胞則出現N-鈣黏蛋白的反常高表達，從而促使癌細胞從癌組織塊上脫離，進一步與內皮或基質成分黏附，最終提高腫瘤細胞的侵襲轉移能力[6]。

本研究結果表明，從正常舌上皮組織到最終的舌鱗癌的發生發展過程中，ZEB1和E-cadherin蛋白的表達依次增高，且在癌旁組織中其表達就開始下降；但是N-cadherin蛋白的表達依次增高，且在癌旁不典型增生組織中其表達就開始上調，表明上皮間質轉化過程可能是舌鱗狀細胞癌發生的早期事件，也就是說上皮間質轉化參與了舌鱗癌的發生和形成。

本研究結果顯示，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達與病人性別及腫瘤大小無關(P>0.05)，而與舌鱗癌TNM分期、組織學分化及淋巴結轉移有關(P<0.05)。ZEB1和E-cadherin在舌癌組織早期(Ⅰ+Ⅱ期)的陽性表達率均高于其在晚期(Ⅲ+Ⅳ期)的陽性表達率，說明舌鱗癌進展程度越高，ZEB1和E-cadherin的表達越低。但是，N-cadherin在舌癌組織早期(Ⅰ+Ⅱ期)的陽性表達率均低于晚期(Ⅲ+Ⅳ期)的陽性表達率，說明舌鱗癌進展程度越高，N-cadherin的表達越高。此外，本研究結果表明舌鱗癌分化程度越低，其腫瘤的惡性程度越高，ZEB1和E-cadherin蛋白的表達越低，而N-cadherin蛋白的表達越高，因此ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的高低可以作為衡量舌鱗癌惡性程度的標志之一。我們還發現，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的表達也與是否發生淋巴結轉移有關，ZEB1和E-cadherin蛋白在有淋巴轉移組中的陽性表達率低于無淋巴轉移組，而N-cadherin蛋白在有淋巴轉移組中的陽性表達率高于無淋巴轉移組，均有顯著性統計學差異(P<0.05)。因此，我們認為ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的高低有可能成為臨床判斷舌鱗癌是否轉移的標志。

在進一步的相關性分析中我們發現，ZEB1的表達與E-cadherin呈現出正相關，而與N-cadherin的表達呈現出負相關；但是E-cadherin表達與N-cadherin的表達呈現出負相關。由此我們認為，臨床上對ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的聯合免疫組化檢測更加有利于準確判斷舌鱗癌的惡性程度及其轉移情況。

綜上所述，我們推測ZEB1可能通過調控E-cadherin和N-cadherin在舌鱗癌組織中的表達，進而影響舌鱗癌的發生、發展和轉移，但是其確切機制尚需要進一步闡明。因此對其進行更加深入細致的研究，將有助于預防舌鱗癌的復發，提高舌鱗癌患者的預后、存活率及生存質量等。

[1] 何升騰.1171例舌癌的治療與預后分析[D].哈爾濱醫科大學,2014.

[2] Iwanami T,Uramoto H,Nakagawa M，et al.Clinical significance of epithelial-mesenchymal transition-associated markers in malignant pleural mesothelioma[J].Oncology，2014，86(2):109-116.

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[6] Liang S, Salas T, Gencaslan E，et al.Tuberin-deficiency downregulates N-cadherin and upregulates vimentin in kidney tumor of TSC patients[J].Oncotarget，2014，5(16):6936-6946.

Expression and Clinical Significance of Epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers in tongue squamous cell carcinoma

ZhuMingyi1,YaoJinguang2,GaoJie1,LuLubi1,LiuJin2.

1.YoujiangMedicalUniversityForNationalities,Baise533000,China. 2.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityForNationalities,Baise533000,China.

Objective To investigate the expressions of Epithelial mesenchymal transition (EMT) markers Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 1(ZEB1), E-cadherin and N-cadherin in tongue squamous cell carcinoma, and their clinical significances thereof. Methods Immunohistochemical streptavidin-peroxidase method was applied to detect expressions of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin in 68 samples of tongue squamous cell carcinoma, 63 samples of tongue cancer adjacent tissues and 68 samples of normal tongue epithelium tissues. Correlations of expressions of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin to clinical pathological parameters and metastasis were analyzed in three groups. Results The expression positive rates of ZEB1 and E-cadherin were significantly lower in tongue squamous cell carcinoma than those in tongue cancer adjacent tissues and normal tongue epithelium tissues(P<0.05). The expression positive rates of N-cadherin were significantly higher in tongue squamous cell carcinoma than those in tongue cancer adjacent tissues and normal tongue epithelium tissues(P<0.05). There were statistical significantly differences in the expression of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin between different TNM stages, differentiation and lymph node metastasis in tongue squamous cell carcinoma (P<0.05). The positive expression of ZEB1 was positively correlated with the positive expression of E-cadherin. The positive expression of ZEB1 was negatively correlated with the positive expression of E-cadherin. Conclusion ZEB1, E-cadherin and N-cadherin play an important role in evolution of tongue squamous cell, it may be involved in the process of tongue squamous cell invasion and metastasis.

Tongue squamous cell carcinoma； Zinc Finger E-Box Binding Homeobox1； E-cadherin； N-cadherin； Epithelial mesenchymal transition

廣西高等學?？蒲许椖縖桂教科研(2012)10號]

R739.86

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1000-744X(2016)03-0243-03

2015-09-21)

△通信作者，E-mail:278793730@qq.com