聯合應激法建立單純心理應激動物實驗模型的研究

徐東寶 王杰 于燕妮 汪元河 黃江 戴佳琳 夏冰

(貴州醫科大學法醫學系法醫司法鑒定中心，貴州 貴陽 550004)

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·論 著·

聯合應激法建立單純心理應激動物實驗模型的研究

徐東寶 王杰△于燕妮 汪元河 黃江 戴佳琳 夏冰

(貴州醫科大學法醫學系法醫司法鑒定中心，貴州 貴陽 550004)

目的 應用聯合應激法建立單純心理應激動物實驗模型。方法 連續給予心理應激(PS)組小鼠隔離應激30 d，并每天隨機給予捕食應激或社會失敗應激1次，末次應激后第2天進行曠場實驗，斷頸取血，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(CORT)水平，并與正常對照(NC)組進行比較。結果 (1)PS組經聯合心理應激后，5 min曠場活動明顯減少(P=0.000)；(2)PS組與NC組比較，血清中CRH、ACTH及CORT水平均明顯升高，差異有統計學意義(P=0.000)。結論 通過聯合應激法，可建立一種可靠的單純心理應激動物實驗模型。

心理應激； 動物實驗模型； 捕食應激； 社會失敗應激； 隔離應激

心理因素可誘導多種疾病的發生，如焦慮、恐懼、孤獨等情緒改變，甚至可導致死亡。但是，心理-社會因素導致疾病發生的原因尚不清楚，給治療造成諸多困難，然而社會醫學倫理又限制對人體心理疾病的研究，動物模型的應用則避免了上述不利因素。本研究旨在通過動物應激狀態對動物行為及內分泌的影響，以期獲得一種成熟的心理應激動物模型的建立方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 30只SPF級雄性昆明小鼠，體質量28～32 g，家貓1只，購自貴州醫科大學動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(黔)2012-001；自由進食飲水，室溫(23±2) ℃，光照12 h(6：00～18：00)，黑暗12 h(18：00～6：00)，捕食應激或社會失敗應激時間為9：00～11：00。

1.2 試劑與儀器 小鼠促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(CORT)酶聯免疫分析試劑盒(北京誠林生物技術有限公司)，ELx800通用型酶標儀(美國Bio Tek公司)，佳能數碼相機(型號：G12)，曠場實驗箱(自制)。

1.3 方法

1.3.1 隔離應激 30只小鼠適應環境1周后，隨機分為心理應激(PS)組和正常對照(NC)組，每組15只。PS組置于安靜的房間進行單籠飼養，自由飲食飲水，盡量減少同外界事物的接觸，連續應激30 d；NC組于安靜的房間進行群居飼養，自由飲食飲水，連續飼養30 d。

1.3.2 捕食應激 PS組小鼠小心輕柔地放入小鼠籠內，連同饑餓1 d的貓一起關入貓籠內，使小鼠與貓可相互看到對方，并能嗅到對方的氣味，但雙方無軀體接觸，利用捕食應激使小鼠產生恐懼、驚嚇等心理應激，使小鼠出現驚恐性顫動及因驚嚇所致呼吸急促而快速鼻翼煽動等。應激時間為出現鼻翼煽動6～8 min(以保證相同的應激強度)。NC組小鼠采用同樣方法放入小鼠籠內后再放入空的貓籠內，同捕食應激小鼠周圍環境相同，靜置6～8 min。

1.3.3 社會失敗應激 每次隨機將2只PS組小鼠放入同一小鼠籠內，待小鼠產生攻擊、防御、逃避、順從等行為，用雙層鐵絲網將二者隔開，保證2只小鼠能看到對方，聽到對方的聲音，聞到對方的氣味，持續應激6～8 min。同籠飼養的NC組隨機2只放入同一小鼠籠內，并用雙層鐵絲網將二者隔開，持續6～8 min。

1.3.4 曠場實驗 將小鼠置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場中心處，任其自由活動5 min。實驗全程使用攝像系統記錄，記錄小鼠5 min內的行為變化，包括垂直運動(兩前爪騰空或攀附墻壁)、嗅探(連續嗅聞2 s以上)、水平運動(身體一半以上進入另一格)次數。每只小鼠實驗完畢后均用清水對曠場實驗箱進行擦拭并徹底干燥，避免殘留氣味對下一只小鼠的影響。實驗完成后找3名對實驗設計不熟悉的人員進行評分，求平均值。

1.3.5 ELISA檢測 所有動物曠場實驗后斷頸處死，取血，全血標本室溫靜置2 h后，離心，取上清，-20 ℃凍存。嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明進行操作，檢測血清CRH、ACTH、CORT水平。

1.4 評價標準 比照E.T.Nestler等[1]所歸納的抑郁動物模型成功與否的判斷原則，心理應激可通過應激后能否出現相應的應激樣行為表現，或出現神經內分泌系統功能失調引起的一系列相關激素的變化，來進行模型有效性的判斷。具體為：(1)行為學評分，包括水平運動、垂直運動和嗅探次數，較NC組平均值明顯降低；(2)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)明顯激活，血清CRH、ACTH、CORT較 NC組平均水平明顯升高。

2 結 果

2.1 小鼠行為學改變 心理應激組較正常組小鼠曠場行為活動(水平運動、垂直運動、嗅探)均明顯降低，且符合上述納入標準(1)的要求，差異具有統計學意義(P=0.000)，見表1。

表1 小鼠曠場實驗結果

2.2 血清中CRH、ACTH、CORT水平的變化 ELISA檢測結果顯示，PS組較NC組小鼠血清中CRH、ACTH、CORT水平均明顯增高，差異具有統計學意義(P=0.000)，見表2。提示心理應激組HPAA明顯激活，滿足上述納入標準(2)，說明心理應激組小鼠處于應激狀態。

組別nCRH/(ng/L)ACTH/(ng/L)CORT/(μg/L)NC組1526．74±3．6639．02±8．73154．48±23．22PS組1539．97±3．9775．80±6．63209．16±16．80Z值-4．625-4．666-4．564P值0．0000．0000．000

3 討 論

目前，較常用的應激動物模型構建方法有束縛應激、強迫游泳、懸吊刺激、創傷應激等，但均對軀體因素的影響較大[2]。本研究選用對軀體因素影響較小的聯合應激法構建應激動物模型，最大限度地降低了軀體因素的影響。據相關文獻[3-6]報道，每種應激方法單一或其中兩種相結合均有明顯的心理應激效果，如活動減少、焦慮、抑郁、社會逃避、探索活動降低等行為表現以及HPAA出現不同程度的激活，但存在不同的缺點，如長期捕食應激過程中CORT水平呈先升高后降低的雙向變化，可能為對應激的適應所致；隔離應激所需的建模時間較長(3～6個月)，過長又可對應激效果產生影響；隔離應激和社會失敗應激早期應激效果明顯，但隨著時間的延長逐漸降低，可能為對刺激的適應或應激抗性所致。

本研究通過對國內常用昆明種小鼠單純心理應激實驗動物模型的構建進行研究分析，參照國內外已報道[2,7]的應激動物模型，選用隔離應激，并每天隨機給予捕食應激或社會失敗應激，這種聯合應激的方法可有效避免實驗動物因適應而對應激效果產生影響，最大限度地保證了每天所給予應激的效果，亦可避免單一因素缺乏模擬應激客觀性的缺點。在效果評價方面，有研究[8]報道，主要通過運用應激后動物生理、行為變化(如應激激素水平增高、抑郁樣行為增多等)，神經生物學的變化(如海馬和內側前額葉皮質體積和細胞增殖降低、樹突狀核形態結構的變化)，以及應用抗抑郁藥物抑郁樣行為能否被逆轉。但神經生物學評價方法在臨床應用中存在較大的困難，尤其是腦組織標本的采集即不符合倫理的要求，同時采集較困難[9]；抗抑郁藥物的作用機制至今尚未完全闡明，不能排除其對腦及其它器官組織的結構和功能產生影響。因此，本研究通過行為學和神經內分泌的方法對實驗動物應激后的心理狀態進行評價，成本低、操作簡便，并且可減小不同個體應激易感性和遺傳因素差異的影響，同時引用實驗室的檢查指標相對客觀、準確。

根據達爾文的生物進化理論，人和動物在相同的心理狀態下表現出相同的行為反映，因此心理應激動物模型的行為學評估具有重要的價值，并且對心理應激致人類疾病的研究具有重要的作用。曠場實驗是一個較成熟的行為學評估方法，可以很好地監測實驗動物的心理狀態[10]。如水平運動可反映動物運動活性，代表其興奮性狀態；垂直運動和嗅探可反映動物探索活性，代表其認知能力。本實驗心理應激30 d后，小鼠的運動探索行為明顯降低，水平運動降低40.5%，垂直運動降低53.2%，嗅探降低48.6%，總行為評分(三者之和)降低42.8%，表現出抑郁、焦慮、恐懼及對周圍事物興趣性降低等行為學特征，與長期慢性心理應激后實驗動物心理行為學表現結果一致[11]，可說明本實驗小鼠聯合應激后處于應激狀態。

在應激反應中HPAA是研究較廣泛的一個關鍵系統，應激時被激活，從而發揮其調節作用。同時，HPAA的功能狀態亦可間接反映機體的應激狀態。研究[12]表明，長期的心理及軀體應激對人體健康的損害程度同HPAA功能的持續亢進有密切的關系。當動物遇到對機體有威脅的信號時，HPAA激活使機體對應激產生抵抗或逃避反應，但當應激長期持續存在時導致HPAA功能持續亢進，即可產生不良后果，使應激激素的負效應增強，如極度疲勞以及失眠、焦慮等抑郁癥的表現。目前，對HPAA功能狀態的評估方法主要有以下幾種[13]：內分泌激素水平監測、行為學變化、覺醒狀態、藥理學研究等。CRH、ACTH及CORT作為HPAA中三種重要的內分泌激素，被認為是研究應激狀態的最經典、最重要的指標之一[14]。因此，本實驗研究通過血清中CRH、ACTH、CORT三種內分泌激素水平變化監測HPAA的功能狀態，發現應激模型組心理應激后三種激素濃度均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(均為P<0.01)，三種激素濃度分別升高49.5%、94.3%、35.4%(表2，ELISA檢測)，表明HPAA被激活，可間接說明實驗動物處于應激狀態，這同國內外報道[14-15]相一致。

因此，本實驗的研究分析表明，通過聯合應激的方法成功地建立了單純心理應激動物模型，曠場活動及血清中CRH、ACTH、CORT水平變化能有效反映動物的應激狀態，是一種可靠的評價應激動物模型的方法。

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Experimental Study on A Pure Psychological Stress Animal Model Established by Combined Application Stress

XuDongbao,WangJie,YuYanni,WangYuanhe,HuangJiang,DaiJialin,XiaBing.

DepartmentofForensicMedicine，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，China.

Objective To build the animal model of pure psychological stress based on combined stress. Methods Mice were randomly divided into psychological stress and control group (n=15/group). After 1-week acclimation, animals were subjected to social isolation stress (30days), and randomized to predator stress (1/day) or social defeat stress (1/day). Open-field test was performed at 24h after the last psychological stress. Then, the average contents of CRH, ACTH and CORT detected by enzyme-linked immuno-sorbent assays were compared with control groups. Results The psychological stress (PS) group mice reduced activity significantly in open-field test (P=0.000). The average contents of CRH, ACTH and CORT were significantly higher in PS mice compared with NC mice (P=0.000). Conclusion The animal model through combined stress is a credible method to establish pure psychological stress.

Psychological stress； Experimental animal models； Predator stress； Social defeat stress； Social isolation stress

國家自然科學基金(81341130)；貴州省高校工程技術研究中心項目[黔科合KY字(2013)114號]；貴州省教育廳產學研基金項目[黔教合KY字(2012)031號]；貴州省科技攻關項目[黔科合NY字(2010)3090]

R-331

A

1000-744X(2016)03-0227-03

2015-11-12)

△通信作者,E-mail:wj6400@gmc.edu.cn