卒中動物模型的研究進展

尹春雨，朱東亞

卒中是影響全球人類健康的重大疾病之一，它具有較高的發病率、致殘率和死亡率。卒中的發病機制相當復雜，按其機制的不同可以分為缺血性和出血性，針對卒中，目前尚缺乏有效的預防和治療手段。顯然，建立并完善與臨床相關性高的卒中動物模型以及對其深入研究，是揭示卒中病理機制的有效途徑，這對卒中新藥研發有著十分重要的意義。本文將對傳統的和改良的缺血性和出血性卒中動物模型的制備方法及其優缺點進行歸納，并對未來卒中動物模型的探究提出相應的展望。

1 腦缺血動物模型

1.1 常用的腦缺血動物模型

1.1.1 線栓法 大腦中動脈閉塞是人類缺血性卒中發生最常見的原因。線栓法局灶性腦缺血模型由于其病理機制與臨床上卒中患者的腦缺血情況類似，因此是目前國內外常用的腦缺血動物模型。1986年Koizumi等[1]首次提出運用非開顱手術的方法阻塞大腦中動脈形成腦缺血模型，而1989年Longa等[2]對此模型進行了改良。其實驗方法是先分離并結扎頸外動脈，同時暫時性結扎頸總動脈。將頸內動脈進行分離，剪斷頸外動脈，從頸外動脈靠結扎線的遠端做一切口，插入尼龍線使其經過頸總動脈分叉進入頸內動脈至有輕微阻力為止，阻斷鄰近的大腦中動脈的所有血供。其優點在于該模型避免了開顱手術，可任意地控制再灌的時間以及是否永久性等，便于實驗的探究。其缺點是：重現性差；要求操作人有專業的手術技能以確保精準地插栓，減少因操作帶來的對其他部位的損傷[3]；會導致蛛網膜下腔出血，從而引起較高的死亡率[4]。

1.1.2 光栓法 1985年Watson等[5]引進光栓法在大鼠腦皮質上產生局灶性腦梗死。該方法的主要原理是用全身給藥的方式腹腔注入玫瑰紅染料然后對大鼠的頭顱局部位置進行光照從而激活光化學反應，光照激活玫瑰紅染料形成自由激進分子形式，導致破壞內皮細胞的功能以及在腦皮質的血管中形成局部血栓。光栓法不是阻塞某一動脈，而是引起大腦皮層中某一特定區域中的微血管阻塞[6]，其形成的腦梗死會產生長期的感覺運動障礙，因此該方法可用于探究慢性卒中的長期功能恢復[7]。優點：該方法實驗過程簡單，無創性；具有較高的重現性和較低的死亡率；可應用在線粒體功能紊亂、炎癥反應、神經退行性疾病等相關方面的研究。缺點：在損傷內皮細胞的同時會破壞血腦屏障以及產生血管性水腫[8]，會產生較小的缺血半暗帶，與人類腦缺血的病理機制不太相符。

1.1.3 栓塞法 栓塞法腦缺血模型在1982年初次應用在大鼠上，Kudo等[9]將較小的凝塊注入頸總動脈或頸內動脈中，替代了線栓法。目前常用的方法是將含有栓塞劑（微球體、自體或異體血凝血塊）的導管植入大腦中動脈中，利用激光多普勒血流計確定栓塞位置，打入栓子后撤回導管。該方法具有臨床相關性，適用于血栓溶解方面的研究，當給予正確位置的栓子時會引起較大的損傷，包括皮層以及皮質下的區域，同時可引起較為顯著的行為學缺陷。缺點：會出現腦出血的情況；具有較高的死亡率；引起多灶性缺血，甚至在對側區域也會有相應的損傷[10]。

1.1.4 血栓栓塞法 血栓栓塞模型十分接近臨床卒中患者腦缺血的病理情況，該模型適用于臨床前對溶栓劑的評價。多數情況下，采用自體取血的方法形成血栓將其注入大腦中動脈或頸內動脈中[11]。該方法的不足之處在于：重現性差，不能保證腦損傷區域的位置和大小[12]；制備血栓易受多因素的影響；不適用于缺血再灌注的研究。

1.2 改良型腦缺血動物模型

1.2.1 微球注入法 微球模型是一種血管內的栓塞型卒中模型，類似于心源性和動脈-動脈的栓塞[12]。將大鼠麻醉后，分離出右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，用5-0縫線結扎甲狀腺上動脈、枕動脈和翼腭動脈，用3-0縫線結扎頸外動脈末端同時暫時性結扎頸總動脈和頸內動脈，在頸外動脈上剪口，插入含有6個TiO2微球體（直徑：0.3～0.4 mm）的導管緩慢注入頸內動脈中，在血流的幫助下使微球體被沖到大腦中動脈的位置，注入完成后用肝素鈉稍沖洗頸內動脈，撤回導管，進行縫合。運用該方法產生的局灶性腦梗死，包括皮質和皮質下區域，避免了對下丘腦產生損傷。通過該方法對腦血流量的時間與空間的動力學、能量代謝、神經炎癥、干細胞再生等方面進行臨床前研究。遺憾的是，此方法不能用于缺血再灌注方面的研究[13]。

1.2.2 改良大鼠血栓法 Zhang等[14]在大鼠上對血栓栓塞模型進行了改造。首先是自體血血栓的制備：取Wistar大鼠股動脈的血流入PE-50管子中使其在37℃條件下孵育2 h，再轉入4℃條件下孵育22 h形成血栓，造模前用0.9%生理鹽水清洗血栓10～15次。其次將大鼠麻醉后，暴露一側頸總動脈，分離頸內動脈與頸外動脈（避免觸碰迷走神經），結扎并剪斷頸外動脈遠端的一側，用動脈夾暫時性夾閉頸總動脈和頸內動脈，從頸外動脈靠結扎線的遠端做一切口，插入含有血栓的PE-50管子使其進入頸內動脈，插至有阻力的位置，打開動脈夾，撤回管子1～2 mm，使用微量注射器以10 μl/min的速度緩慢注入血栓，注入完成后停留5 min，確保血栓到達頸外動脈/頸內動脈的交叉點，再次用動脈夾暫時性夾閉頸總動脈和頸內動脈，撤回PE-50管子，結扎頸外動脈上的切口，縫合傷口。改良后的大鼠血栓法形成腦缺血可模擬人類缺血性卒中的實際情況，該方法適用于研究溶栓和溶栓與神經保護劑聯合用藥。但是其產生的梗死灶的位置和大小變異性大，容易發生再灌注的現象。

1.2.3 改良小鼠血栓法 Chen等[15]將小鼠氣體麻醉后，在顯微鏡下分離暴露小鼠右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎并剪斷頸外動脈，同時暫時性結扎頸總動脈和頸內動脈，在頸外動脈上剪口，將含有2 NIHU α-凝血酶的PE-8導管插入切口中將其緩慢注入頸外動脈中，注入完成后從頸外動脈中吸取3 μl血流入導管中，然后在空氣中暴露15 min形成血栓。其次暫時性結扎頸總動脈和頸內動脈，將含有血栓的導管再次順著頸外動脈的切口進入到頸內動脈中，使導管的尖端位于距大腦中動脈1～2 mm處，緩慢注入血栓10 min后，撤回導管，結扎頸外動脈，釋放頸總動脈。全過程在激光多普勒血流儀的監測下進行，可觀察到血栓的位置以及形成情況。該方法所需時間較短，僅在單次麻醉下，采用自體取血的方法，精確定位血栓的位置，產生重現性較好的局部腦梗死，具有較低的死亡率，同時避免了開顱手術和硬腦膜的滲透。為缺血性腦損傷的研究提供了新的思路與方法。

1.3 其他

1.3.1 猴腦缺血模型 Zhang等[16]將受試猴全身麻醉后，暴露顱骨，從左外側前額葉皮層處打開硬腦膜，在大腦中動脈的左側M1部位，距嗅束2 mm處，用5 mm鈦合金動脈夾短暫性夾閉4 h后，移去動脈夾形成血流再灌。用激光多普勒血流計監測前額葉皮層中的相對腦血流量（relative cerebral blood flow，rCBF）的變化。

1.3.2 狒狒腦缺血模型 Huang等[17]將狒狒通過左側經眶顱骨切除術暫時性夾閉身體同側的頸內動脈、脈絡叢前動脈以及雙側大腦前動脈A1近端的前交通動脈，夾閉1 h。這種方法不僅可以引起皮質以及皮質下灰質的損傷，還可以引起皮質下白質的受損。同時，可減少側支循環的可變性，產生較為穩定的梗死區域[18]。

1.3.3 犬腦缺血模型 為了更好地模擬臨床卒中患者發病情況，實現向臨床的轉化，Christoforidis等[19]在犬的椎動脈中置入導引導管，將含有栓塞線圈的微導管插入到該導管內，在熒光顯微鏡下使其經脊分支動脈、基底動脈、后交通動脈到達大腦中動脈，將微導管內的栓塞線圈注入大腦中動脈中，通過血管造影儀觀察線圈的位置是否正確，阻塞60 min，結果導致部分閉塞大腦中動脈M1段、頸內動脈的遠端和大腦前動脈的始端位置，60 min后取出線圈撤回導管。該模型可準確定位栓塞位置，當位置不準確時，可進行重新定位。

1.3.4 家兔腦缺血模型 目前，家兔微血栓栓塞性卒中模型用于急性腦梗死的相關研究，然而該模型存在許多限制性因素，English等[20]對其進行改造。該模型是在熒光顯微鏡下，利用血管造影技術將1.5 F微導管通過左側椎動脈至基底動脈進而插入到右側大腦后動脈中，使微導管的尖端位于右側大腦后動脈的始端，持續不同的時間形成不同程度的大血管阻塞。將微導管撤回后形成血流再灌。該方法的優點在于可以精確定位栓塞的位置，產生時間依賴型的皮質及皮質下區域的損傷，重復性較強，可以準確控制阻塞和血管再生的時間，有利于進行可逆和不可逆的急性腦缺血的研究。

1.3.5 自發性腦缺血模型 將易卒中型自發性高血壓大鼠用2.0%異氟烷麻醉后，在顯微鏡下，沿腹側中線切開，暴露右側頸總動脈并進行結扎。該方法可產生局灶性腦缺血，破壞血腦屏障以及點狀出血，可引起血管周圍炎癥和認知功能障礙[21-22]。

2 腦出血動物模型

2.1 常用的腦出血動物模型

2.1.1 自體血注入法 該模型是將不同體積的自體血通過立體定位的方法注入動物的紋狀體中形成腦血腫，會出現腦血腫以及周圍腦區的CBF減少的現象，這種現象依賴于自體血的體積量，但不引起腦灌注壓力的改變。通過注入自體血產生的腦出血并不會破壞脈管系統[23]。有文獻報道，使用注入半凝結的自體全血的方法，6 min內注入60 μl會導致組織學上明顯的變化以及神經系統的障礙[24]。優點：能夠模擬出血性卒中患者的出血情況。缺點：重復性差；由于心室破裂以及血液順著針孔的回流，因而無法預計血腫的程度和大小。就現階段研究來看，自體血注入法模型是較為理想的有效腦出血模型，與臨床上腦出血的情況十分類似，便于研究其病理生理變化及腦血流的改變情況，為腦出血的臨床治療提供有力的證據。

2.1.2 膠原酶注入法 膠原酶是蛋白水解酶，在細胞中以非活性形式存在。該模型的主要原理是利用膠原酶的酶促反應破壞血管的基膜引起血液向周圍組織滲漏。該方法的優點在于重復性強，可形成較一致的出血體積。然而與自體血注入法不同的是注入膠原酶會破壞脈管系統，同時使腦血腫膨脹變大[25]，還會產生其他非出血性的反應，破壞其他類型的血管，如毛細血管[23]，與臨床上腦出血情況有一定的差別。由于膠原酶自身可引起炎癥反應，因此該方法不適用于研究腦出血后的炎癥反應相關機制。

2.2 改良型腦出血動物模型

2.2.1 蛛網膜下腔出血動物模型 蛛網膜下腔出血會導致神經功能嚴重紊亂，出現如偏癱、情感障礙、認知和記憶功能受損。Li等[26]將C57BL/6J小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（80 mg/kg）進行麻醉后，首先將激光多普勒血流儀置于小鼠左側顳骨處監測左側半球的血流情況。其次分離小鼠左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，在頸外動脈處剪開約3 mm小口，將6-0尼龍線從頸外動脈切口處插入頸內動脈至有阻力為止，約距頸總動脈分支點1.0 cm，稍刺破血管2 mm處。該方法是首次在小鼠上利用血管穿刺的方法形成蛛網膜下腔出血的動物模型。

2.2.2 向小腦延髓池注射血液致蛛網膜下腔出血動物模型 Guvenc Tuna等[27]將Wistar大鼠用2%異氟烷麻醉后，進行針穿刺寰枕關節膜，將0.2 ml動脈血注入小腦延髓池內，為了防止血液回流，注入完成留針數分鐘后緩慢撤回。該模型的優點在于可根據注射的血液量及注射的次數調節蛛網膜下腔出血的嚴重程度，但其缺點在于屬于非生理性血液分布。

2.2.3 自發性腦出血模型 該方法是將易卒中型自發性高血壓大鼠用戊巴比妥（45 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，在右側股動脈插入導管進行取血100 μl，將大鼠腦固定在立體定位儀上，頭部正中切開，暴露前囟點，使前囟點與后囟點在同一水平上（坐標：距前囟點前0.2 mm，旁開3.5 mm，深度5.5 mm），用腦立體定位鉆進行鉆孔，將針植入右側基底神經節，使100 μl自體血緩慢注入右側基底神經節中（速度：10 μl/min），注射完畢留針10 min后緩慢退針，用骨蠟封閉針眼，縫合皮膚。該模型取自體動脈血，導致的腦出血與臨床上高血壓腦出血患者的發病情況十分類似，然而在發生腦出血時，由于無法選擇出血區域，不易控制出血量，死亡率較高[28]。

3 總結與展望

本文對于各種缺血性和出血性卒中動物模型的制作方法及其優缺點進行了分析闡述。各種模型具有各自的優缺點，可根據不同的實驗目的選擇相應的實驗動物模型。卒中受多因素影響，其發病機制較為復雜，因此，選擇重現性高、臨床相關性高的動物模型研究卒中的發病機制，對卒中新藥研發具有十分重要的臨床意義。

當前，一味地針對動物模型的重現性進行的改良已經不能滿足人們對于卒中病理機制探索的要求。如何對卒中動物模型進行改進使其與臨床患者情況更加吻合，仍然是目前醫學科研者需要解決的難題。同時，如何將在動物模型上的最適藥物劑量轉化到臨床患者上，以及腦組織損傷后嚙齒類動物與人類的不同免疫系統反應，也是一個巨大的挑戰。因此明確模型動物和人類的種屬差異，并選擇合適的行為學檢測方法對于研究受試藥物的藥理學效應及其臨床轉化也是十分重要的。所以，探索出更接近人類卒中發病過程的動物模型迫在眉睫，這可能會進一步加深人們對于卒中病理機制的認識，進而開發出利于轉化的藥物，為卒中的治療開辟新的道路。

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