淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型COX-2表達的影響

甄 瑾，王梅玲，朱潤秀，肖 梅，傅永旺，郭建雄

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淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型COX-2表達的影響

甄 瑾，王梅玲，朱潤秀，肖 梅，傅永旺，郭建雄

目的 觀察淫羊藿苷(ICA)對脂多糖(LPS)誘導的阿爾茨海默病(AD)炎癥模型大鼠海馬內環氧酶-2(COX2)表達的影響。方法 將36只Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、ICA低劑量組[ICA30 mg/(kg·d)]、ICA高劑量組[ICA120 mg/(kg·d)]，側腦室注射脂多糖建立AD炎癥模型(對照組注射生理鹽水)，連續灌胃2周，每天1次，斷頭取腦，免疫組化法(SP法)檢測大鼠海馬內COX-2蛋白的表達，用圖像分析系統對染色結果進行分析；通過SYBR GREENⅠ熒光定量PCR檢 測大鼠海馬內COX-2 mRNA的表達情況。結果 與模型組相比，高劑量組COX-2蛋白及mRNA的表達明顯降低(P<0.01)，但仍明顯高于對照組(P<0.01)，低劑量組COX-2蛋白及mRNA的表達與模型組比較無統計學意義(P>0.05)。結論 高劑量淫羊藿苷可降低AD炎癥模型大鼠海馬內COX-2的表達，可抑制炎癥反應對神經細胞的損傷。

阿爾茨海默?。灰蜣杰?；內環氧酶-2；脂多糖

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的老年神經變性疾病，臨床上表現為隱匿起病、緩慢進展、逐漸加重的癡呆和精神行為異常，是癡呆的最常見原因。隨著世界人口老齡化，癡呆已成為老年人群中繼心血管病、癌癥、中風之后的第四大“殺手”，為家庭和社會帶來嚴重的負擔。AD的病因和發病機制尚未明了，目前認為是遺傳、環境等多因素致病的復雜病理過程。證據顯示炎癥反應機制在AD的發病和進展中發揮著重要作用。流行病學研究結果顯示：長期服用非甾體抗炎藥可以明顯降低AD的發病率，并嘗試用抗炎藥物治療AD。治療AD的中醫方劑中淫羊藿占有重要地位，淫羊藿提取物淫羊藿苷(Icariin，ICA)具有抗炎作用。本實驗旨在觀察ICA治療后的AD炎癥模型大鼠海馬內環氧酶合-2(COX-2)的表達，并探討ICA對AD模型的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 RM八臂迷宮分析測試系統，JD801圖像分析系統，7300實時熒光PCR儀，S-P試劑盒，DAB顯色液，抗COX-2多克隆抗體濃縮型，反轉錄酶，COX-2引物，GAPHD引物，淫羊藿苷，脂多糖。

1.2 實驗動物 健康普通成年雄性Wistar大鼠36只，體重200 g～260 g，購自內蒙古大學實驗動物中心，均為清潔級動物，分組分籠飼養，充分光照，每12 h明暗交替，控制室溫18 ℃～21 ℃，標準飼料喂養，自由進水，在進行八臂迷宮實驗前限制大鼠飲食，使其體重維持在自由進食體重的80%～85%。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及AD模型制備 八臂迷宮訓練成功[1]的Wistar大鼠36只隨機分為4組，分別為對照組、模型組、低劑量組[ICA30 mg/(kg·d)]、高劑量組[ICA120 mg/(kg·d)]，每組Wistar大鼠9只。大鼠八臂迷宮訓練成功后次日通過側腦室注射5 μg/μL LPS溶液10 μL誘導AD炎癥模型。定位參照George Paxinos[2]的《大鼠腦立體定位圖譜》。造模后次日八臂迷宮實驗觀察大鼠的空間記憶能力以判定模型的成敗[1]。

1.3.2 給藥方法及取材 大鼠側腦室注射后次日起，連續相應灌胃14 d，每天1次，對照組和模型組給予蒸餾水灌胃，低劑量組給予ICA30 mg/(kg·d)灌胃，高劑量組給予ICA120 mg/(kg·d)灌胃。八臂迷宮測試完成后24 h內2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg～50 mg/kg)。斷頭取腦，一側大腦立即放入液氮保存，用于RT-PCR 定量檢測；另一側多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。

1.3.3 免疫組織化學法 參照津脈公司提供的免疫組化試劑盒檢測步驟進行免疫組化S-P法染色檢測COX-2的表達。COX-2蛋白均定位于胞漿，細胞漿出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機觀察5個高倍視野，利用生物醫學圖像分析系統對圖像進行分析，測定灰度值。

1.3.4 RT-PCR檢測 提取RNA并反轉錄，應用SYBR GREENⅠ熒光定量PCR檢測AD模型大鼠大腦海馬組織內COX-2mRNA表達，具體方法參照試劑盒說明書進行。結果分析處理用相對定量方法測定?；虮磉_量=2-△CT，用△CT法計算干擾結果，公式為：△CT未知樣品=CT未知樣品-CT內參，內參為大鼠持家基因GAPDHmRNA。

2 結 果

2.1 各組大鼠海馬內免疫組化COX-2的表達 免疫組化染色顯示各組海馬內均有COX-2的表達。與 模型組比較，高劑量組COX-2表達明顯減少(P<0.01)，但仍明顯高于對照組(P<0.01)；低劑量組 COX-2的表達與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 各組大鼠海馬內COX-2mRNA的表達 與模型 組比較，高劑量組COX-2mRNA的表達明顯減少(P<0.01)，但仍明顯高于空白對照組(P<0.01)；低劑量組COX-2mRNA的表達與模型組比較無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 COX-2在各組大鼠海馬內的表達(±s)

3 討 論

研究發現AD腦組織中炎癥反應標志物有增高趨勢，腦組織的淀粉樣斑塊中有多種補體因子及抑制因子。AD病人腦內的β淀粉樣蛋白(Aβ)可激活小膠質細胞、星形膠質細胞產生炎癥反應，并通過炎癥介質如IL-1、IL-6、COX-2等引起神經元的損害?；ㄉ南┧?arachidonic acid，AA)代謝通路是炎癥的核心網絡，環氧合酶(cyclooxygenases，COXs)是 AA 代謝途徑中的關鍵酶，會導致一系列炎癥因子的產生，在AD發病機制中起重要作用[3]。在AD的非常早期階段，當β淀粉樣蛋白只有少量沉積，皮質區極少量神經纖維纏結的時候，神經元內COX-2表達即增多，其表達水平與炎癥的嚴重程度呈正相關[4]。 COX-2是核因子信號轉導的靶目標之一，證據表明核因子κB(NF-κB)、COX-2與AD的炎性反應過程關系密切，COX-2及其產生的NF-κB信號通路參與神經元的死亡機制[5-6]。長期服用抑COX的非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)可明顯降低AD發病相對危險系數[7]，但嚴重的胃腸道毒副作用限制了傳統 NSAIDs在AD病人中的應用。Heneka等[8]的研究證實非甾體類抗炎藥物布洛芬能減少轉基因小鼠MG和星型膠質細胞的活化數量，降低COX-2的產生而減輕大腦組織的氧化損傷。抑制活化的COX-2可能通過抑制炎癥反應和自由基損傷，進而改善老年性癡呆的認知能力障礙。本研究結果顯示，AD炎癥模型給予高劑量ICA治療后COX-2表達明顯減少，表明ICA可抑制中樞炎癥反應、抑制膠質細胞的活化與增殖進而改善AD模型大鼠的學習記憶能力。

[1] 甄瑾，李潤今，王梅玲.淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠記憶能力及其海馬內GFAP，TNF-α，IL-6表達的影響[J].中西醫結合心腦血管雜志，2013，11(2):192-194.

[2] George Paxinos，Charles Wharles Watson.The rat brain in stereotaxic coordinates [M].諸葛啟，譯.第3版.北京:人民衛生出版社，2005：6.

[3] Sanchez-Mejia RO，Mucke L.Phospholipase A2and arachidonic acid in Alzheimer’s disease[J].Biochim Biophys Acta，2010，1801：784-790.

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[5] Imbimbo BP，Solfrizzi V，Panza F.Are NSAIDs useful to treat Alzheimer’s disease or mild cognitive impairment? [J].Front Aging Neurosci，2010，26(1):156-160.

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[7] Imbimbo BP， Solfrizzi V， Panza F.Are NSAIDs useful to treat Alzheimer’s disease or mild cognitive impairment? [J].Front Aging Neurosci，2010，2：1.

[8] Heneka MT，Sastre M，Dumitrescu-Ozimek L，et al.Acute treatment with the PPARγ agonist pioglitazone and ibuprofen reduces glial inflammation and Aβ1-42 levels in APPV717I transgenic mice[J].Brain，2005，128(6)：1442-1453.

(本文編輯郭懷印)

The Influence of Icariin on the Expression of COX-2 in Rats with Alzheimer-like Model

Zhen Jin，Wang Meiling，Zhu Runxiu，Xiao Mei，Fu Yongwang，Guo Jianxiong

Inner Mongolian People’s Hospital，Huhhot 010017， Inner Mongolia，China

Objective To investigate the influence of icariin (ICA)on the expression of cyclooxygramse 2 (COX-2)in inflammational rat model hippocampus with Alzheimer’s disease(AD) induced by lipopolysaccharides(LPS). Methods Thirty-six rats were allocated into 4 groups:control group，model group，low-dose ICA group and high-dose ICA group.The rat models of AD were induced by being injected LPS into the lateral cerebral ventricle. After two weeks of intragastric administration，brain tissue of rats was removed. The expressions of COX-2 protein and mRNA in hippocampus of the rats were detected by immunohistochemistry(SP method)and SYBR GREEN fluorescence quantitative RT-PCR. Results The expressions of COX-2 protein and mRNA in high-dose ICA group were significantly lower than those in model group (P<0.01). Conclusion The high-dose ICA can reduce the expression of COX-2 in inflammational rat model hippocampus of AD and can inhibit the inflammatory reaction of nerve cells injury.

Alzheimer’s disease;icariin；cyclooxygramse 2；lipopolysaccharides

內蒙古自然科學基金(No.200711020933)

內蒙古自治區人民醫院(呼和浩特 010017)，E-mail:zhenjin2006106@126.com

引用信息：甄瑾，王梅玲，朱潤秀，等.淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型COX-2表達的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2629-2630.

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.012

1672-1349(2016)22-2629-02

2016-05-02)