黃芪多糖對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

沈玉玨

?

黃芪多糖對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

沈玉玨

目的 研究黃芪多糖(APS)對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 分離并培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞72 h后分為：空白對(duì)照組、H2O2組、APS(20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L)+H2O2組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；給藥干預(yù)24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，通過流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況并計(jì)算凋亡率；測(cè)定細(xì)胞中抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]活性和丙二醛(MDA)含量，培養(yǎng)液中心肌酶[谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)]含量，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析，RT-PCR法檢測(cè)AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)并計(jì)算bcl-2/Bax表達(dá)比值。結(jié)果 與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；細(xì)胞中SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量顯著降低，細(xì)胞中caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低，AKT mRNA和bcl-2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，Bax mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，bcl-2/Bax表達(dá)比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 APS可能通過改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、降低NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)、上調(diào)抗凋亡基因表達(dá)并下調(diào)促凋亡基因表達(dá)、提高bcl-2/Bax表達(dá)比值，從而對(duì)H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡起抑制作用。

黃芪多糖；心肌細(xì)胞；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；心肌酶

目前，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其所引發(fā)的急性心肌梗死已經(jīng)逐漸發(fā)展成為常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重危害著人們的生命健康和生活質(zhì)量；臨床上主要采取溶栓、介入支架手術(shù)等治療手段及時(shí)恢復(fù)血流供應(yīng)，能夠挽救部分心肌梗死病人生命，但“再灌注損傷”并發(fā)癥的存在往往嚴(yán)重影響著心肌梗死病人預(yù)后。缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡是其重要的病理基礎(chǔ)[1-2]。黃芪多糖(Astraglus polysaccharides，APS)是我國傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分之一[3]，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種藥理學(xué)作用[4-8]。本實(shí)驗(yàn)將通過H2O2誘導(dǎo)制備乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型，研究APS對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物與試劑 黃芪多糖(西安沃森生物科技有限公司，批號(hào)：20131205)； DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；甲基四唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海時(shí)代生物科技有限公司)；核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、caspase-3單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；AKT、bcl-2、Bax上下游引物(上海博亞生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠1 d～3 d乳鼠[9]，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003，動(dòng)物合格證號(hào)：150406007。

1.3 主要儀器 SW-4T-2F潔凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)； NU-4850E型CO2培養(yǎng)箱(美國Nu Aire公司)；VCX750型超聲波細(xì)胞破碎儀(美國SONICS公司)；UV762型紫外-可見分光光度計(jì)(上海楚定分析儀器有限公司)；BS-300型全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；iMark型酶標(biāo)儀、FACS Aria型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；DYY-11 型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽(北京六一儀器廠)；RT-PCR儀(武漢新未來儀器技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 乳鼠心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)[9]與分組 細(xì)胞的分離：無菌環(huán)境下開胸取心臟并剪取心室組織，剪碎、加入0.1%的胰酶后于37 ℃振蕩消化6 min，去上清、沉淀繼續(xù)用0.1%胰酶于37 ℃振蕩消化6 min，如此循環(huán)直至組織碎塊消化完畢，收集消化上清液，1 500 r/min離心10 min，取沉淀，加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(10%胎牛血清 DMEM，內(nèi)含105 U/L的青霉素和鏈霉素)，吹打均勻，壁立 1.5 h。收集未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至 6×108個(gè)/L，接種于35 mm培養(yǎng)器皿中，37 ℃，5% CO2，100%濕度，培養(yǎng)72 h后，將狀態(tài)良好的原代乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、H2O2(200 μmol/L)組、APS(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2(200 μmol/L)組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，檢測(cè)各指標(biāo)。

1.4.2 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 參照王知斌等[10]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定各組細(xì)胞存活率：藥物干預(yù)24 h后，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(n=6)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)振蕩15 min，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值，然后計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%

1.4.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)及細(xì)胞凋亡率的計(jì)算 藥物干預(yù)24 h后，經(jīng)0.25%的胰酶消化后離心棄上清液，PBS溶液將沖洗2次后，按照AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作方法步驟依次進(jìn)行處理，避光孵育10 min后行Flow Cytometry檢測(cè)，觀察各組細(xì)胞凋亡狀況并在流式二維圖中計(jì)算凋亡率。

1.4.4 細(xì)胞中SOD、CAT活性和MDA含量的測(cè)定 藥物干預(yù)24 h后，棄培養(yǎng)基取細(xì)胞，每孔加入2 mL PBS溶液，于冰浴中破碎處理30 s后，低溫離心取上清液，然后通過紫外-可見分光光度計(jì)平行測(cè)定各組細(xì)胞裂解液中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.5 培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量的測(cè)定 藥物干預(yù)24 h后，分別取各組培養(yǎng)液并按照各試劑盒操作方法進(jìn)行處理，然后通過全自動(dòng)生化分析儀平行測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量。

1.4.6 細(xì)胞中NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取1.4.3制備的細(xì)胞裂解提取液，經(jīng)12 000 r/min低溫離心10 min后取沉淀，行BCA法蛋白定量，變性后上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色后，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB， caspase-3，β-actin)4 ℃過夜；洗膜，二抗室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.4.7 細(xì)胞中AKT mRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表達(dá)的檢測(cè)及bcl-2/Bax比值的計(jì)算 查閱大鼠AKT、bcl-2、Bax、β-actin基因cDNA序列并通過Oligo軟件設(shè)計(jì)上、下游引物：AKT：上游5′-TTTATTGGCAGGGAACG-3′，下游5'-AGTCTG AATGGCGGTGGT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為213bp；bcl-2上游5′-CCTTTGTGTAACT GTACGGCC-3′，5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為317bp；Bax上游5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游5′-TCCCGGAGGAAGT CCATT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度282 bp；β-actin上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAA -3′，下游5′-AAAGAAAGGGAGTAAACCGCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度432bp。常規(guī)消化后收集各組細(xì)胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測(cè)定總RNA濃度，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增完畢后，取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內(nèi)參，由灰度值進(jìn)行半定量分析AKT mRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表達(dá)，并計(jì)算bcl-2/Bax表達(dá)比值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞存活率 與空白對(duì)照組比較，H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)。詳見表1。

2.2 各組細(xì)胞凋亡狀況 空白對(duì)照組乳鼠心肌細(xì)胞存在極少量凋亡細(xì)胞，H2O2組細(xì)胞凋亡數(shù)量較空白對(duì)照組明顯增多；而經(jīng)APS干預(yù)24 h后，能夠顯著改善H2O2誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況，以APS(80 μmol/L)+H2O2組效果最為顯著(見圖1)。計(jì)算凋亡率發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)；而與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。詳見表1。

注：A為空白對(duì)照組；B為H2O2組；C為APS(20 μmol/L)+H2O2組； D為APS(40 μmol/L)+H2O2組；E為APS(80 μmol/L)+H2O2組。圖1 各組細(xì)胞凋亡情況表1 各組細(xì)胞存活率和凋亡率(±s) %

2.3 各組細(xì)胞中SOD、CAT活性和MDA含量 與空白對(duì)照組比較，H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、CAT活性顯著降低，且MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組SOD、CAT活性顯著升高，且MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 各組細(xì)胞中SOD、CAT活性和MDA含量(±s)

2.4 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量 與空白對(duì)照組比較，H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量顯著升高(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組AST、CPK、LDH含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量(±s)

2.5 各組細(xì)胞NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá) 通過Western blot檢測(cè)并進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組比較，H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞中NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2和表4。

注：A為空白對(duì)照組；B為H2O2組；C為APS(20 μmol/L)+H2O2組； D為APS(40 μmol/L)+H2O2組；E為APS(80 μmol/L)+H2O2組。圖2 各組細(xì)胞凋亡情況表4 各組NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)量(±s)

2.6 各組細(xì)胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)及bcl-2/Bax比值 與空白對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組AKT mRNA、bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高，而Bax mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.01)。詳見表5。

表5 各組細(xì)胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)及bcl-2/Bax比值(±s)

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一種由多種基因參與調(diào)控的程序化死亡過程，AKT為抗凋亡基因，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)及整個(gè)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[11]；Bcl-2家族基因在細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中bcl-2為抑凋亡基因、Bax為促凋亡基因，二者間相互作用共同調(diào)控細(xì)胞凋亡過程[12]；并且bcl-2和Bax對(duì)細(xì)胞凋 亡的調(diào)控不僅與二者表達(dá)程度有關(guān)，可能更依賴于bcl-2/Bax表達(dá)比值，bcl-2/Bax比值越低往往凋亡狀況越嚴(yán)重[13]；Caspases 蛋白家族參與細(xì)胞凋亡啟動(dòng)以及整個(gè)過程的調(diào)節(jié)，其中caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵蛋白酶[14]。

細(xì)胞凋亡具有多種誘發(fā)因素，包括氧化應(yīng)激損傷[15]。NF-κB為多效能核轉(zhuǎn)錄因子，被稱為連接氧 化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的“橋梁”[16]。生理狀態(tài)下，NF-κB以無活性形式存在于胞質(zhì)中，而當(dāng)細(xì)胞受到ROS攻擊時(shí)，NF-κB將被活化并暴露出核定位信號(hào)而進(jìn)入胞核內(nèi)；Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)：活化NF-κB能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤，誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，證實(shí)NF-κB激活與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生成的ROS在SOD和CAT的依次催化作用下最終還原生成對(duì)人無害的H2O和O2[18-19]，因此SOD、CAT的活性直接反映機(jī)體抗氧化能力。此外，血清中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映細(xì)胞損傷程度。正常生理狀態(tài)下，血清中心肌酶含量非常低，而當(dāng)細(xì)胞膜受氧自由基攻擊而受損后將導(dǎo)致細(xì)胞中心肌酶(AST、CPK、LDH)迅速釋放入血，導(dǎo)致血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，因此血清中三者的活性水平能夠敏感地反映心肌細(xì)胞受損程度，它們也是臨床上監(jiān)測(cè)心功能的常用指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組比較，經(jīng)APS干預(yù)24 h能夠有效提高H2O2誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率、降低細(xì)胞凋亡率、改善抗氧化酶活性、抑制心肌細(xì)胞損傷、上調(diào)抗凋亡基因AKT和bcl-2表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax基因表達(dá)、提高bcl-2/Bax表達(dá)比值、降低caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)，提示APS對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其作用機(jī)制可能與APS能夠有效抑制氧化應(yīng)激損傷以及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1] 劉艷霞，顧云，辛毅，等.大鼠急性心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].心肺血管病雜志，2009，28(3)：191-194.

[2] 孫宇，陳建光.細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，10(1)：34-43.

[3] Chen HL，Li DF，Chang BY，et al.Effects of Chinese herbal polysaccharides on the immunity and growth performance of young broilers[J].Poult Sci，2003，82(3)：364-370.

[4] 李紅法，郭松波，滿淑麗，等.乙醇分級(jí)沉淀提取黃芪多糖及其理化性質(zhì)和抗氧化活性研究[J].中國中藥雜志，2015，40(11)：2112-2116.

[5] 于勝，曹瓊丹，魯美麗，等.黃芪多糖對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31(4)：102-105.

[6] 巢蕾，周杰，朱萱萱，等.黃芪多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞系MKN45的生長(zhǎng)抑制作用及細(xì)胞周期的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(11)：2474-2477.

[7] 李承德，周文賓，孫艷，等.黃芪多糖對(duì)哮喘大鼠Th17/Treg細(xì)胞因子及肺部炎癥的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(9)：1275-1278.

[8] 陳丹，丹宋亮，劉麗娟，等.黃芪多糖對(duì)肺氣虛小鼠免疫調(diào)節(jié)作用[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30(3)：35-37.

[9] 李澎，王建農(nóng)，盧樹杰，等.山楂葉原花青素對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志，2009，34(1)：96-99.

[10] 王知斌，翟亞東，蘇曉琳，等.二氫槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中醫(yī)藥信息雜志，2014，31(4)：16-19.

[11] 葉強(qiáng)，陳良海，劉應(yīng)才，等.辛伐他汀通過 Akt/GSK3β通路抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(12)：1656-1660.

[12] 張彥清，劉保江，田首元.丙泊酚對(duì)大鼠離體缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡和Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011，9(1)：55-57.

[13] Jayanthi S，Deng X，Bordelon M，et al.Methamphetamine causes differential regulation of pro-death and anti-death Bcl-2 genes in the mouse neocortex[J].FASEB J，2001，15(10)：1745-1752.

[14] 毛德文，陳月橋，王麗，等.Caspase-8及Caspase-3與細(xì)胞凋亡[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(10)：148-150.

[15] 陳良金，石孟瓊，賀海波，等.珠子參總皂苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17(8)：860-867.

[16] 楊帆，王永青，彭余江，等.NF-κB在顱腦損傷后繼發(fā)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系研究[J].浙江創(chuàng)傷外科，2014，19(6)：899-902.

[17] Zhang Q，Huang WD，Lv XY，et al.Ghrelin protects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling [J].Eur J Pharmacol，2011，654(2)：142-149.

[18] Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase：the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J].J Virol， 2014，2588(14)：254-261.

[19] Jin Y，Liu K，Peng J，et al.Rhizoma dioscoreae nipponicae polysaccharides protect HUVECs from H2O2-induced injury by regulating PPARγ factor and the NADPH oxidase/ROS-NF-κB signal pathway[J].Toxicol Lett，2014，232(1)：149-158.

(本文編輯郭懷印)

Effects of Astraglus Polysaccharides on the Cadiocytes Apoptosis Induced by H2O2in Neonatal Rat

Shen Yujue

Handan Central Hospital，Handan 056001，Hebei，China

Objective To investigate the effects of astraglus polysaccharides (APS) on the cadiocytes apoptosis induced by H2O2in neonatal rat. Methods Cadiocytes of neonate rat was cultivated for 72 hours and divided into six groups：normal control group，H2O2group，APS (20，40，80 μmol/L) plus H2O2groups(n=10). Twelve hours after the drugs were given，the survival rate was detected by MTT assay.The cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated.The activity of superoxide dismutate(SOD)，catalase (CAT) and the content of malondialdehyde (MDA) in cardiomyocytes were determinted.The content of aspartate aminotransferase(AST)， creatine phosphokinase(CPK)， lactate dehydrogenase (LDH) in culture medium were detected.The expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB)，caspase-3 protein was detected by western blot and Semi-quantitative analysized.The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA，Bax mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)and the ratio of bcl-2/Bax was calculated. Results Compared with the H2O2group，the survival rate in APS(40，80 μmol/L) plus H2O2groups was significantly increased.The cardiomyocytes apoptosis was improved and the apoptosis rate was significantly decreased.The activities of SOD，CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased.The contents of AST，CPK，LDH in culture medium were significantly decreased.The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA were significantly up-regulated，while the expression of Bax mRNA was significantly down-regulated，the ratio of bcl-2/Bax was significantly increased.The expression of NF-κB，caspase-3 protein were significantly down-regulated.All of the difference above were significant (P<0.05 or P<0.01). Conclusion APS had inhibitive effects on neonatal rat cadiocytes apoptosis induced by H2O2，which perhaps related to its effects of improving the activity of antioxidase，depressing oxidative stress，down-regulating the expression of NF-κB，caspase-3 protein，up-regulating the expression of anti-apoptotic genes and down- regulating the expression of pro-apoptotic genes，raising the ratio of bcl-2/Bax.

astraglus polysaccharides；H2O2；cardiomyocytes；superoxide dismutate；catalase；myocardial enzymes

河北省邯鄲市中心醫(yī)院(河北邯鄲 056001)，E-mail：zhjkhg@163.com

引用信息：沈玉玨.黃芪多糖對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2616-2621.

R329.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.008

1672-1349(2016)22-2616-06

2016-05-04)