參芍膠囊對心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟過氧化損傷的影響

趙桂峰，黃欣瑋，吳麗玉，毛靜遠

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參芍膠囊對心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟過氧化損傷的影響

趙桂峰1，黃欣瑋2，吳麗玉2，毛靜遠1

目的 觀察參芍膠囊預處理對心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠心臟組織和功能及過氧化損傷、抗氧化能力的影響。方法 采用左冠狀動脈前降支結扎30 min，再灌注120 min制備心肌缺血再灌注損傷模型。將30只雄性Wistar大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、參芍膠囊250 mg/kg組、參芍膠囊500 mg/kg組和阿托伐他汀組，每組6只。術前用藥7 d。再灌注后生理記錄儀記錄血流動力學變化，生化法檢測血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)及心肌組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)含量。結果 與模型組比較，參芍膠囊高、低劑量組與阿托伐他汀組CK-MB和LDH均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與參芍膠囊250 mg/kg組比較，參芍膠囊500 mg/kg組和阿托伐他汀組LDH顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，參芍膠囊250 mg/kg組左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)值明顯升高(P<0.05)；參芍膠囊500 mg/kg組和阿托伐他汀組LVSP和-dp/dtmin值明顯升高(P<0.05)，+dp/dtmax值顯著升高(P<0.01)，左心室舒張末壓(LVEDP)值明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，參芍膠囊高低劑量組與阿托伐他汀組心肌中丙二醛(MDA)明顯降低(P<0.05或P<0.01)，超氧化物氣化酶、谷胱甘肽過氧化物酶明顯升高(P<0.05或P<0.01)。結論 參芍膠囊預處理能夠抑制MIRI后大鼠心肌損傷，改善心臟血流動力學狀態，抑制膜脂過氧化產物的生成及提高機體抗氧化損傷能力。

參芍膠囊；心肌缺血再灌注損傷；過氧化損傷；肌酸激酶同工酶

參芍膠囊(Shen shao capsule，SS)由人參莖葉皂甙和白芍制成的中藥制劑，其主要藥效物質基礎為人參皂苷Rg1、Re、芍藥苷。具有活血化瘀，益氣止痛的功效，適用于氣虛血瘀所致的胸悶、胸痛、心悸、氣短等癥。現代研究表明其藥效物質在心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)過程中發揮抗氧化損傷、減輕鈣超載和抑制心肌細胞凋亡的作用[1-2]，但未見該復方在防治MIRI方面的報道。本實驗采用大鼠在體MIRI模型，觀察參芍膠囊預處理對MIRI心臟的保護作用和過氧化機制的影響。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 健康成年雄性Wistar大鼠30只[北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001]，體重250 g～300 g。隨機分為5組：假手術組(Sham)、模型組(I/R)、參芍膠囊250 mg/kg組(SS250)、參芍膠囊500 mg/kg組(SS500)和阿托伐他汀組(Ator)，每組6只。參芍膠囊按照成人正常劑量(8粒/日)和兩倍劑量設為高、低劑量組，阿托伐他汀組按照成人10 mg/d劑量并依據人與大鼠體表面積換算。假手術組和模型組予等量生理鹽水。預灌胃1周，每天上午給藥1次，自由飲食、飲水。

1.2 試劑和儀器 參芍膠囊(保定步長天浩制藥有限公司，批號150701)，阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，批號L14582)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，酶標儀(BIO RAD，美國)，PowerLab/4SP(ML750，澳大利亞)，全自動生化分析儀(日立7020，日本)，紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司，756MC)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠MIRI模型 將各組大鼠于術前禁食12 h，自由飲水，記錄大鼠體重，并于麻醉前1 h灌胃，之后用5%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定，消毒左側胸前及腋下皮膚，胸部備皮。記錄Ⅱ導聯心電圖。沿左側第3、4肋間(或心臟搏動最明顯處)剪開左胸皮膚約1 cm，用止血鉗逐層分離皮下組織。在心臟搏動最明顯處用彎止血鉗撐開胸廓，將心臟擠出胸腔，持5/0無創縫合針絲線(上海元洪醫療器械有限公司)，于肺動脈圓錐與左心耳之間，在離左冠狀動脈前降支(LAD)起始部約2 mm處進針，深度1 mm左右，在結扎處預先墊一根1/0粗棉線，而后把冠脈及棉線一起進行結扎，第二結為滑結，隨后立即把心臟送回胸腔并排氣凈血，再用直頭止血鉗夾閉皮膚及肌肉層，造成心肌缺血。心電圖示ST段抬高并與T波融合，結扎線下心肌組織發紺，說明心肌缺血模型成功[3-4]。30 min后松開止血鉗，恢復血流灌注，S-T段下降1/2以上，標志再灌注成功(見圖1)，其中假手術組在冠狀動脈前降支下只穿線不進行結扎，其余處理同上。

圖1 心電圖變化

1.3.2 血流動力學檢測 再灌注結束前15 min再次將大鼠麻醉，并分離右頸總動脈，經右頸總動脈行左心 室插管，連壓力換能器接放大器，通過多道生理記 錄儀，記錄左心室收縮未壓(LVSP)、左心室舒張 末壓(LVEDP)，并記錄左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)、下降速率(-dp/dtmin)，同步記錄心率(HR)。

1.3.3 心肌酶及氧化應激檢測 再灌注結束即刻，大鼠腹主動脈取血6 mL，37 ℃水浴鍋靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，按照各試劑盒說明書檢測血清中CK-MB、LDH水平。再灌注結束后，剪破左心耳，用冰氯化鈉注射液經腹主動脈將心臟沖洗干凈并剪下用濾紙吸干。以生理鹽水為介質，用勻漿器制成10%心肌組織勻漿。SOD、MDA和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)含量的測定按照試劑說明書進行。

2 結 果

2.1 大鼠CK-MB和LDH比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清中CK-MB和LDH活性均顯著增加 (P<0.01)；與模型組比較，參芍膠囊250 mg/kg組CK-MB和LDH活性均明顯降低(P<0.05)，參芍膠 囊500 mg/kg組CK-MB和LDH活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，阿托伐他汀組也呈降低趨勢(P<0.01)；與參芍膠囊250 mg/kg組比較，參芍膠囊 500 mg/kg組和阿托伐他汀組LDH活性顯著降低 (P<0.01)，阿托伐他汀組CK-MB活性明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 參芍膠囊對MIRI大鼠血清CK-MB、 LDH活性的影響(±s) U/L

2.2 大鼠心肌組織SOD、MDA和GSH-PX結果比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中MDA含量顯著增加(P<0.01)，SOD、GSH-PX活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，參芍膠囊250 mg/kg組MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD、GSH-PX活性明顯增高(P<0.05)；參芍膠囊500 mg/kg組及阿托 伐他汀組MDA含量顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH-PX活性明顯增高(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 參芍膠囊對MIRI大鼠心肌組織中 SOD、MDA和GSH-PX的影響(±s)

2.3 大鼠心臟血流動力學比較 與假手術組比較，模 型組大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmin值顯著降低，LVEDP值顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，參芍膠囊250 mg/kg組+dp/dtmax值明顯升高(P<0.05)；參芍膠囊500 mg/kg組和阿托伐他汀組LVSP和-dp/dtmin值明顯升高(P<0.05)，+dp/dtmax值顯著升高(P<0.01)，LVEDP值明顯降低(P<0.05)。各組之間HR值比較差異無統計學意義。詳見表3。

表3 參芍膠囊對MIRI大鼠血流動力學的影響(±s)

3 討 論

MIRI指缺血心肌組織在血液重新灌流后，出現更嚴重、更明顯的功能障礙及損傷，甚至導致心肌發生不可逆損傷的現象。其中氧自由基的大量產生導致細胞膜的脂質過氧化，引起細胞膜破壞，導致細胞功能障礙甚至壞死。由氧自由基等導致心肌細胞的能量代謝障礙到心臟收縮舒張功能的異常再到心臟組織細胞的死亡是MIRI的主要病理進展。如何減輕過氧化損傷，改善MIRI后心臟功能的障礙進而減少心肌細胞的死亡仍是當今研究熱點，實驗研究表明中醫藥對防治MIRI有顯著效果。前期研究發現參芍膠囊在抗大鼠動脈粥樣硬化過程中可以增強機體清除氧自由基的能力， 減輕脂質過氧化程度，改善血管內皮細胞功能[5]。

本研究首先從心臟功能障礙和心肌損傷兩個方面探討參芍膠囊對MIRI大鼠心臟的作用。然后進一步研究該藥對過氧化損傷的干預機制。本實驗發現，大鼠心肌缺血再灌注損傷后LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmin明顯下降，而LVEDP明顯上升，提示MIRI大鼠左室功能顯著下降。經參芍膠囊預干預后各指標均得以明顯改善，同時發現參芍膠囊高劑量組在改善心臟功能方面具有更好的效果。在減輕心肌及組織損傷方面，參芍膠囊高、低劑量組均有保護作用，但高劑量組在降低LDH方面優于低劑量組，差異有統計學意義。由于LDH不具有心肌組織的特異性，所以結果可能提示該藥對心肌組織具有保護作用，可減輕MIRI后全身的氧化應激損傷，其機制有待進一步研究。氧自由基和不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，其代謝產物為MDA，并具有細胞毒性。SOD、GSH-PX作為氧自由基清除劑，將其催化生成O2和H2O等終產物。在機體自由基代謝過程中，SOD可以將過氧化物自由基轉變為過氧化氫，再通過過氧化氫酶的作用分解成為氧氣和水。GSH-PX能催化氧化型谷胱甘肽轉變為還原型，促進H2O2的分解，從而保護細胞膜的結構及功能。參芍膠囊能夠明顯降低MDA含量，提高心肌組織中SOD、GSH-PX活性，發揮心肌保護作用。參芍膠囊高低劑量組在清除氧自由基和改善心室功能方面均有效，但高劑量具有更好的趨勢。

綜上所述，參芍膠囊能夠改善MIRI大鼠心臟功能，減輕心肌損傷。其干預機制與減少體內氧自由基的產生和提高機體抗氧化損傷能力有關。氧化應激與炎癥在MIRI過程中密切相關，炎癥信號通路的激活導致內皮細胞受損，中性粒細胞激活，氧自由基大量產生，促進氧化應激的進展。參芍膠囊兩種成分的作用機制及配伍規律將在以后的研究中進一步探討。

[1] Lim KH，Lim DJ，Kim JH.Ginsenoside-Re ameliorates ischemia and reperfusion injury in the heart：a hemodynamics approach[J].J Ginseng Res，2013，37(3)：283-292.

[2] Nizamutdinova IT，Jin YC，Kim JS，et al.Paeonol and paeoniflorin，the main active principles of Paeonia albiflora，protect the heart from myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J].Planta Med，2008，74(1)：14-18.

[3] 劉付平，姚宏偉，李俊.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的改進[J].安徽醫科大學學報，2003(3)：234-236.

[4] 侯夢夢，邢冬梅，劉璇，等.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立的關鍵性問題[J].天津中醫藥大學學報，2014(6)：323-326.

[5] 劉文敏，李亞芹，孫建紅.參芍膠囊對動脈粥樣硬化大鼠血清SOD及MDA水平的影響[J].時珍國醫國藥，2009(10)：2482-2483.

(本文編輯郭懷印)

The Influence of Shenshao Capsule Preconditioning on Heart Oxidative Damage in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Zhao Guifeng，Huang Xinwei，Wu Liyu，Mao Jingyuan

First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300381，China

Mao Jingyuan

Objective To observe the effect of Shenshao capsule (SSC)preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI)in rat heart and the mechanism of oxidative damage and antioxidant capacity.Methods In this study， besides sham group， the left anterior descending coronary artery of other wistar rats were occluded 30 min and reperfused 120 min in MIRI model.Thirty rats were randomly divided into sham group， ischemia/reperfusion group，low and high dose SSC group (250 mg/kg and 500 mg/kg)，and atorvastatin 10 mg/kg group，pre-treated for 7 days. After the end of the reperfusion，physiological recorder was used to measure the cardiac hemodynamic changes. The contents of serum creatine kinase isoenzyme MB(CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH) and the myocardial tissue malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD)， glutathione peroxidase (GSH-PX) were detected by automatic biochemical analyzer. Results Compared with model group， the contents of serum CK-MB and LDH were significantly lower in low and high dose SSC group and atorvastatin group(P<0.05 or P<0.01). Compared with low dose SSC group， the content of LDH was significantly lower in high dose SSC group and atorvastatin group (P<0.01).Compared with model group，+dp/dtmaxvalue increased significantly in low dose SSC group(P<0.05).LVSP and -dp/dtmin value increased (P<0.05)， +dp/dtmaxvalue increased significantly (P<0.01)， LVEDP value decreased (P<0.05)in high dose SSC group and atorvastatin group.Compared with model group，the contents of myocardial MDA significantly lower，the contents of SOD and GSH-PX increased significantly in low and high dose SSC group and atorvastatin group(P<0.05 or P<0.01).Conclusion SSC pretreatment can inhibit myocardial injury in rats after MIRI，improve cardiac hemodynamic state，inhibit the generation of membrane lipid peroxidation products and improve the body’s ability to resist oxidative damage.

Shenshao capsule；myocardial ischemia reperfusion injury；oxidative damage；creatine kinase isoenzyme MB

2012年度教育部“創新團隊發展計劃”中醫藥防治心血管疾病研究(No.IRT1276)

1.天津中醫藥大學第一附屬醫院(天津 300381)；2.天津中醫藥大學

毛靜遠，E-mail：jymao@126.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.007

1672-1349(2016)22-2613-04

2016-09-19)

引用信息：趙桂峰，黃欣瑋，吳麗玉，等.參芍膠囊對心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟過氧化損傷的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2613-2616.