穩(wěn)心顆粒對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞肥大模型骨架蛋白的影響

任曉萌，陳 鈺，李 潔，吳麗君，楊欣宇，吳愛明，邢雁偉，商洪才，高永紅

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

穩(wěn)心顆粒對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞肥大模型骨架蛋白的影響

任曉萌1，3，陳 鈺2，李 潔3，吳麗君1，楊欣宇1，3，吳愛明1，邢雁偉3，商洪才1，高永紅1

目的 研究穩(wěn)心顆粒(WXKL)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞肥大模型骨架蛋白的影響。方法 體外培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，經(jīng)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)復(fù)制心肌細(xì)胞肥大模型，加入5 g/L穩(wěn)心顆粒后，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及對(duì)骨架蛋白的影響。結(jié)果 經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞橫向拉伸，腫脹變大，細(xì)胞體積較正常心肌細(xì)胞增大；加入穩(wěn)心顆粒后 H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，但還是比正常細(xì)胞橫向?qū)挾仍黾印?yīng)用激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常 H9C2細(xì)胞經(jīng)10-7mol/L AngⅡ刺激48 h后，細(xì)胞形態(tài)明顯腫脹變大，細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度分別由(120.32±8.36)μm和(51.82±8.62)μm增加到(182.67±7.81)μm和(92.22±7.56)μm。加入穩(wěn)心顆粒作用 24 h后，AngⅡ組的H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度為(160.35±5.66)μm、(55.87±4.52)μm。結(jié)論 穩(wěn)心顆粒在AngⅡ誘導(dǎo)的肥厚心肌H9C2細(xì)胞模型中，能改善細(xì)胞骨架蛋白，起到一定的改善心肌肥厚的作用。

心肌肥厚；H9C2心肌細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ；穩(wěn)心顆粒

益氣活血中藥穩(wěn)心顆粒(WXKL)是臨床上有確切療效治療肥厚性心律失常的中成藥。而心肌肥厚是伴隨許多心血管事件發(fā)生過程中出現(xiàn)的病理變化，臨床上常見的原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓、心肌梗死、瓣膜病、先天性心臟病等都會(huì)伴有心肌肥厚的發(fā)生。雖然早期心肌肥厚是心臟為適應(yīng)各種刺激而產(chǎn)生的心肌細(xì)胞體積增大，重量增加，有利于維持正常的心功能，但由于心肌肥厚本身也可增加心肌耗氧量、降低心肌順應(yīng)性，所以長(zhǎng)時(shí)間肥厚的程度超過心肌所能承受的范圍，會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，增加猝死的發(fā)生率[1]。本實(shí)驗(yàn)通過建立模擬血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞肥大模型，觀察穩(wěn)心顆粒對(duì)其骨架蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 H9C2細(xì)胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織，從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心(Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC)，即北京協(xié)和細(xì)胞資源中心購(gòu)買。購(gòu)買時(shí)為第22代。

1.2 藥物 穩(wěn)心顆粒(山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，批號(hào)：120620)；血管緊張素Ⅱ(A9525，Sigma公司，美國(guó))。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司，美國(guó))，超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠，中國(guó))，光學(xué)倒置顯微鏡 (型號(hào)：Olympus IX70，奧林巴斯，日本)，激光共聚焦[OLYMPUS FLUOVIEW laser scanning confocal microscopes FV1000 Viewer(Ver.1.6)]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM 高糖液體培養(yǎng)基(北京邁晨科技公司，中國(guó))，胎牛血清(Gibco，美國(guó))，胰酶，雙抗(Solarbio 中國(guó))，Rhodamine Phalloidin(Lifetechnologies，R-415)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 H9C2心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 根據(jù)實(shí)際情況，用改良的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞[2]。放置在 37 ℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱中于含10 % 胎牛血清的高糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá) 90%以上時(shí)，給予傳代培養(yǎng)，一般細(xì)胞傳代時(shí)間控制在細(xì)胞培養(yǎng)后 2 d ～ 3 d。

1.4.2 心肌細(xì)胞肥大模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型[3]。AngⅡ溶液[4]：用去離子水配制成10-5mol/L母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)2 mL的培養(yǎng)基中加入20 μL 10-5mol/L AngⅡ，終濃度達(dá)到10-7mol/L，即100 nmol/L，細(xì)胞給藥48 h。穩(wěn)心顆粒溶液：用生理鹽水配制成終濃度為5 g/L，細(xì)胞給藥24 h。實(shí)驗(yàn)分3組。Control組：正常H9C2細(xì)胞，不加藥物，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；AngⅡ組：正常H9C2細(xì)胞，加AngⅡ培養(yǎng)48 h后再培養(yǎng)24 h；AngⅡ+ WXKL組：正常H9C2細(xì)胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入WXKL 作用 24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將H9C2細(xì)胞種植于35 mm培養(yǎng)皿中，用10-7mol/L的AngⅡ刺激48 h后，再用5 g/L WXKL作用 24 h，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、大小。

1.4.4 激光共聚焦測(cè)細(xì)胞骨架蛋白 采用免疫熒光染色法，提前1 d按2.5×105/孔密度接種H9C2細(xì)胞到激光共聚焦專用玻底96孔板。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS沖洗3次，每次5 min。用0.1 % Triton X-100穿透液室溫下穿透細(xì)胞5 min，用PBS沖洗3次，每次5 min。用PBS稀釋(2.5 μL)羅丹明鬼筆環(huán)肽成200 μL工作液，固定20 min，用PBS沖洗3次，每次5 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，分別在各組細(xì)胞中隨機(jī)選取10 個(gè)細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞長(zhǎng)度和寬度，取平均值，比較各組細(xì)胞的大小。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)心顆粒對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)肥大H9C2細(xì)胞形態(tài)改善作用 Control組的正常細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，用10-7mol/L AngⅡ刺激48 h的H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞橫向拉伸，腫脹變大，細(xì)胞體積較Control組略有增大。而用5 g/L WXKL作用 24 h后，H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，但比Control組細(xì)胞橫向?qū)挾仍黾印Ｔ斠妶D1。

注：A為正常H9C2細(xì)胞；B為H9C2細(xì)胞經(jīng)10-7mol/L AngⅡ 刺激48 h；C為正常H9C2細(xì)胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入穩(wěn)心顆粒作用 24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 穩(wěn)心顆粒對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥厚心肌細(xì)胞的影響(×200)

2.2 穩(wěn)心顆粒對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)肥大H9C2骨架蛋白的作用(見表1) 在觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，Control組的H9C2細(xì)胞經(jīng)10-7mol/L AngⅡ刺激48 h后，細(xì)胞形態(tài)明顯腫脹變大(見圖2 A)，細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度增加(P<0.01)(見圖2B和圖2C)。而用5 g/L WXKL作用 24 h后，AngⅡ組的H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度降低(P<0.05)(圖2D)。

表1 各組細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度比較(±s) μm

注：A為正常H9C2細(xì)胞；B為H9C2細(xì)胞經(jīng)10-7mol/L AngⅡ 刺激48 h；C為正常H9C2細(xì)胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入穩(wěn)心顆粒作用24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

與Control 組比較，**P<0.01；與 AngⅡ組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖2 穩(wěn)心顆粒衰減細(xì)胞肥大

3 討 論

心肌肥厚是心臟為適應(yīng)各種刺激而產(chǎn)生的心肌細(xì)胞蛋白合成增加，肌節(jié)數(shù)量增多并伴有纖維組織增生。其病理變化包括心肌細(xì)胞體積增大、重量增加、直徑增寬或長(zhǎng)度增寬，心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖以及心臟細(xì)胞外基質(zhì)改變等方面，即心室重構(gòu)[5]。心肌重構(gòu)是心臟在內(nèi)外因素的刺激下，產(chǎn)生的一系列形態(tài)學(xué)和功能學(xué)適應(yīng)性變化，隨著刺激因素的持續(xù)和增強(qiáng)，最終心臟功能失代償而發(fā)展成心力衰竭。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活是引起心肌重構(gòu)和心力衰竭的最主要內(nèi)源性因素之一[6]。從細(xì)胞和分子水平看，心肌細(xì)胞肥大的過程中，機(jī)械信號(hào)通過刺激生長(zhǎng)因子釋放AngⅡ激活應(yīng)力感受器，包括：牽拉敏感離子通達(dá)、整合素超家族以及細(xì)胞骨架將信號(hào)傳遞至核內(nèi)[5]。AngⅡ是RAAS系統(tǒng)的重要組成部分，與心血管事件的發(fā)生發(fā)展是密不可分的，能夠直接作用于心肌細(xì)胞誘導(dǎo)肥大[6-7]。細(xì)胞骨架的改變?cè)谛募》屎窈托募∈湛s阻力變化方面的作用近年來逐漸受到重視。有研究顯示[8]其本身在心肌細(xì)胞肥大、衰竭過程中微管蛋白發(fā)生了數(shù)量變化，或者穩(wěn)定性增加，同時(shí)細(xì)胞黏性系數(shù)增加，也說明了細(xì)胞骨架改變有可能參與了心肌肥大和心力衰竭的發(fā)病過程。心肌細(xì)胞的細(xì)胞骨架還決定細(xì)胞的順應(yīng)性[9]。馮冰等[10]利用細(xì)胞骨架解聚劑觀察了細(xì)胞骨架系統(tǒng)在牽張刺激心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)中的作用，其理論依據(jù)是機(jī)械刺激可能通過骨架拉動(dòng)把力學(xué)信息傳遞進(jìn)入細(xì)胞核而引起心肌肥大反應(yīng)。牟嬌等[11]研究表明細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和正常功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在肥大心肌細(xì)胞中的變化可能是細(xì)胞在外界致病因素作用下代償性調(diào)節(jié)的一種表現(xiàn)。由此會(huì)影響心肌收縮的阻力，心肌的收縮功能減弱，更容易近一步發(fā)展為心力衰竭。同時(shí)，細(xì)胞骨架作為一種信號(hào)傳導(dǎo)通路，能夠接受細(xì)胞來自外界的刺激信號(hào)。通過檢測(cè)肥大心肌細(xì)胞骨架蛋白含量及其磷酸化水平，肥大細(xì)胞內(nèi)的主要骨架蛋白成分，包括微管、微絲以及接蛋白等，結(jié)果顯示：骨架蛋白表達(dá)都會(huì)有不同程度的異常增加情況，反而其磷酸化水平表現(xiàn)為明顯降低。心肌肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制非常復(fù)雜[12]，一般從細(xì)胞水平將心肌肥大分為3個(gè)環(huán)節(jié)，即胞外的肥大刺激信號(hào)、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞肥大表型變化，如細(xì)胞體積增加、收縮蛋白積聚、蛋白合成增加、收縮性蛋白聚合成肌小節(jié)單位等。

穩(wěn)心顆粒作為一個(gè)作用于心肌肥厚及治療心律失常的中藥組方，由黨參、黃精、琥珀、三七、甘松等復(fù)方組成。具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、定悸安神、寧心復(fù)脈的功效，是抗心律失常的純中藥制劑，能夠抗心律失常，改善心肌供血，降低心肌耗氧量[13]。王國(guó)欽等[14]實(shí)驗(yàn)顯示:穩(wěn)心顆粒具有恢復(fù)心肌肥厚的作用，能恢復(fù)心肌細(xì)胞的形態(tài)以及細(xì)胞骨架蛋結(jié)構(gòu)，從而可以逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。本研究采用普通光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察穩(wěn)心顆粒對(duì)H9C2心肌細(xì)胞骨架蛋白的作用。采用熒光免疫法進(jìn)行熒光染色并觀察，研究顯示：正常H9C2心肌細(xì)胞在經(jīng)過10-7mol/L AngⅡ誘導(dǎo)后，細(xì)胞明顯變形，增寬，增長(zhǎng)，而在穩(wěn)心顆粒作用后可以改善由AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大程度。

對(duì)于心肌肥厚，從細(xì)胞骨架到信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)向愈加受到關(guān)注，其中細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳遞是誘導(dǎo)心肌肥大的最重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[12]。課題組[15]通過觀察穩(wěn)心顆粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣(Ca2+)-鈣調(diào)蛋白(CaM)-鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)作用，探討其對(duì)心肌梗死大鼠模型心律失常的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明：穩(wěn)心顆粒治療心力衰竭和心律失常的機(jī)制可能與其對(duì)CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。結(jié)合本研究中穩(wěn)心顆粒對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的改善作用，對(duì)二者之間的作用途徑，我們將進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

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(本文編輯郭懷印)

The Influence of Wenxin Granule on the Cytoskeleton Protein in Ang Ⅱ Induced H9C2 Cell Hypertrophy Model

Ren Xiaomeng，Chen Yu，Li Jie，Wu Lijun，Yang Xinyu，Wu Aiming，Xing Yanwei，Shang Hongcai，Gao Yonghong

Key Laboratory of Chinese Interna Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，100053，China

Gao Yonghong (Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

Objective To study the effect of Wenxin granule (WXG)on the cytoskeleton protein of angiotensin Ⅱ(AngⅡ)induced H9C2 cell hypertrophy model. Methods H9C2 cells were cultured in vitro，the model of cardiomyocyte hypertrophy was induced by AngⅡ. After dosing WXG with 5 g/L， the morphological changes of the cells and the cytoskeleton were observe. Results The morphological of H9C2 cell induced by AngⅡhad changes，cell transverse tensile，swelling becomes larger，cell volume vs normal cells.After with the addition of WXG，H9C2 myocardial cell morphology had been restored，but still larger than the transverse width of normal cells. And the discovery of cell morphology were observed under confocal laser scanning microscopy (CLSM)，cell morphology was apparent swelling becomes larger，the length and the width of the cell respectively by 120.32 μm±8.36 μm and 51.82 μm±8.62 μm increased to 182.67 μm±7.81 μm and 92.22 μm±7.56 μm. After 24 hours of WXG， H9C2 myocardial cell morphology in AngⅡ group had been restored，the length and the width of the cell to 160.35 μm±5.66 μm，55.87 μm±4.52 μm. Conclusion In H9C2 cell model of hypertrophic myocardium induced by AngⅡ，the WXKL can improve the cytoskeletal protein，which plays a role in improving cardiac hypertrophy.

cardiac hypertrophy；H9C2 cells；angiotensin Ⅱ；Wenxin granule

國(guó)家自然基金(No.81373935，81430098)；北京中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)杰青項(xiàng)目(No.2015-JYB-XJQ001)

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京100700)；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院

高永紅，E-mail：gaoyh7088@163.com

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.006

1672-1349(2016)22-2609-04

2016-08-02)

引用信息：任曉萌，陳鈺，李潔，等.穩(wěn)心顆粒對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞肥大模型骨架蛋白的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2609-2612.