內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群ABCA1基因69C/T多態(tài)性分布特點及其與血脂和冠心病的關(guān)系

袁托亞，劉曉宇，王悅喜

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內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群ABCA1基因69C/T多態(tài)性分布特點及其與血脂和冠心病的關(guān)系

袁托亞，劉曉宇，王悅喜

目的 探討ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)基因69C/T單核苷酸多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中的分布特以及其與血脂和冠心病的關(guān)系。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長度多態(tài)性方法檢測101例蒙古族冠心病病人和102名正常對照組ABCA1基因相應(yīng)片段的多態(tài)性。結(jié)果 ABCA1基因69C/T TT基因型和T等位基因頻率在冠心病組均顯著高于正常對照組(P<0.05)；經(jīng)相對危險度分析TT基因型的相對危險度OR=2.698，95%CI為1.408～5.170，P<0.05，說明TT基因型是冠心病的危險因素。ABCA1基因69C/T TT、TC、CC三種基因各基因型高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 ABCA1基因69C/T多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族冠心病病人的遺傳易感性相關(guān)，TT基因型病人增加冠心病的危險性。

冠心病；三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1；基因多態(tài)性；血脂

隨著基因組酶切和測序的進展，從分子遺傳學(xué)角度研究冠心病病因已成為可能，這將為冠心病的預(yù)防 和治療提供新的途徑。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族的成員，如果ABCA1基因突變，使膽固醇外流障礙[1]，膽固醇和膽固醇脂在巨噬細胞內(nèi)積聚而成為泡沫細胞，繼而浸潤血管壁，促進動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展。目前，尚未見ABCA1基因69C/T多態(tài)性在蒙古族中的相關(guān)報道，本研究對203例蒙古族受試者進行了ABCA1 69C/T基因變異檢測和血脂檢測，以探討這種基因變異與冠心病的關(guān)系及其對血脂的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象均為蒙古地區(qū)蒙古族人群。選擇2008年12月—2016年3月我院心內(nèi)科行冠狀動脈造影陽性(至少1支冠狀動脈直徑狹窄≥50%)，并根據(jù)1979年世界衛(wèi)生組織(WHO)冠心病標準診斷為冠心病的病人101例(冠心病組)，年齡(59.4±11.7)歲；正常對照組102名，年齡(58.3±12.8)歲。經(jīng)詢問病史、體檢、實驗室檢查(血、尿、便常規(guī)，血脂，血糖，肝、腎功能)、心電圖、胸片、心臟彩超、心肌灌注發(fā)射型計算機斷層掃描(ECT)顯像、64排冠狀動脈CT、冠狀動脈造影等檢查確診為冠心病。通過問卷訪談收集研究對象的基本資料、家族史、既往史、吸煙和飲酒史等。吸煙史的標準為過去1年或1年以上每天吸煙10支以上。剔除標準：風濕性疾病、大動脈炎、血液病、結(jié)核、腫瘤、嚴重肝腎功能不全等。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平的檢測 所有化驗檢查均采用次日清晨空腹采取靜脈血3 mL，分離血清測定血脂水平，三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)以氧化酶法測定，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用PEG變構(gòu)酶法測定，試劑均為Leadman公司生產(chǎn)。儀器為日本OLYMPUS AU 600全自動生化分析儀。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周靜脈血3 mL，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩０凑昭?細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明提取血液DNA(由TIANGEN公司提供)。

1.2.3 設(shè)計引物 設(shè)計PCR引物，引物由Sangon公司合成，上游引物：5′GGCTTTGACCGATAGTAACCT 3′，下游引物：5′CTCTTTCTCCTACCCCTTGAC 3′。

1.2.4 ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴增 PCR反應(yīng)在PTC-200型循環(huán)儀中進行。PCR 反應(yīng)體系50 μL，包括：2×Taq PCR MasterMix (由TIANGEN公司提供)25 μL，DNA 2.0 μL，上游和下游引物分別1.0 μL(10 μmoL)，滅菌超純水21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共25個循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的酶切消化 酶切反應(yīng)體系20 μL：PCR產(chǎn)物10 μL，BsmA I內(nèi)切酶(由Fermantas公司提供)0.4 μL，10×Buffer 2.0 μL，滅菌超純水7.6 μL，置于37 ℃酶切16 h。取酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測并確定樣品基因型。DNA Marker為BioMarkerⅠ(由BioFluk公司提供)。

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組與正常對照組一般資料比較 冠心病組與對照組年齡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。對冠心病組和對照組的基因型分布進行了平衡檢驗，χ2檢驗表明兩種基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。

2.2 69C/T各基因型和等位基因分布(見表1) 冠心病組TT型和T等位基因頻率均明顯高于正常對照組(P<0.05)，CC型和C等位基因分布頻率均明顯低于正常對照組(P<0.05)。經(jīng)相對危險度分析TT基 因型的相對危險度OR=2.698，95%CI為1.408～5.170，P<0.05，這說明蒙古族TT基因型個體增加冠心病的患病危險。

表1 蒙古族69C/T基因型及等位基因分布 例(%)

2.3 蒙古族69C/T三種基因型血脂比較(見表2) 蒙古族人群CC、TC、TT三種基因型HDL-C、LDL-C、TG、TC比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 蒙古族族69C/T三種 基因型血脂比較 (±s) mmol/L

2.4 69C/T基因PCR產(chǎn)物及酶切電泳圖(見圖1、圖2)

注：M為50bp DNA Ladder (標記物)，1、2、3、4、5、6為177bp的PCR產(chǎn)物。

圖1 包含69C/T位點PCR產(chǎn)物2.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

注：M為100bp DNA Ladder(標記物)。

圖2 69C/T酶切產(chǎn)物及marker電泳圖

3 討 論

在普通人群中，基因變異最常見的方式是單核苷酸多態(tài)性，單核苷酸多態(tài)性系指人類基因組中大量存在的單個核苷酸的差異，它是一種DNA變異，包括缺失、插入、置換、顛換、移碼、錯義等類型，占全部基因組DNA變異的90%左右。核苷酸序列的一定差異決定了不同人種和不同個體的差異，以及不同人群疾病易感性和對藥物治療敏感性的差異。目前人們越來越關(guān)注正常人、冠心病人群中的ABCA1基因多態(tài)性與血脂、冠心病的關(guān)系，ABCA1基因中一些常見的多態(tài)性與血脂水平、動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病年齡及嚴重程度明顯相關(guān)[2]。有些變異因其ABCA1功能障礙使血漿HDL-C水平降低，冠心病的危險性明顯增加，如R230C 、R1587K、V825I[3-4]。有些變異使HDL-C水平增高[5]，具有抗動脈粥樣硬化和降低冠心病危險性的作用，如R219K[6]。而在啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性增加冠心病的危險性，如C69T[7]。但其對血脂改變沒有影響。

Versmissen等[7]研究結(jié)果表明在啟動子區(qū)69C/T基因TT型基因病人患冠心病的風險是CC型的1.7倍，這與本研究結(jié)果基本一致。本研究重點分析內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族ABCA1 69C/T基因，通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長度多態(tài)性方法(PCR- RFLP)檢測蒙古族ABCA1 69C/T多態(tài)性，冠心病組TT型頻率明顯高于正常對照組，而CC型頻率明顯低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)相對危險度分析TT基因型的相對危險度OR=2.698，95%CI為1.408～5.170，P<0.05，這說明蒙古族人群TT基因型個體增加冠心病的患病危險。而各基因型與血脂的相關(guān)研究表明：各基因型病人血脂改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)以上結(jié)果，推測其原因可能為TT基因型是在不影響血脂情況下增加冠心病的發(fā)生率及患病風險，其機制是通過影響膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運過程但不影響血脂水平而實現(xiàn)的。

總之，本研究結(jié)果初步顯示蒙古族ABCA1基因中69C/T TT基因型是冠心病的危險因素。但冠心病是一個受多基因、多因素影響的疾病，冠心病的危險因素還包括不同基因(同時存在其他基因位點改變或調(diào)控基因的影響)、民族、年齡、飲食、高血壓、糖尿病、吸煙史、家族史等，具體機制還需要進一步的大樣本研究工作來明確。

[1] Kyriakou T，Pontefract DE，Viturro E，et al.Functional poly-morphism in ABCA1 influences age of symptom onset in coronary artery disease patients[J].Hum Mol Genet，2007，16(12)：1412-1422.

[2] Kyriakou T，Pontefract DE，Viturro E，et al.Functional polymorphism in ABCA1 influences age of symptom onset in coronary artery disease patients[J].Hum Mol Genet，2007，16 (12)：1412-1422.

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(本文編輯郭懷印)

Detection of Polymorphism of ABCA1 Gene 69C/T and Its Association with Blood Lipids Level and Coronary Heart Disease in Mongolian Population

Yuan Tuoya，Liu Xiaoyu，Wang Yuexi

The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Huhhot 010050， Inner Mongolia，China

Liu Xiaoyu

Objective To investigate whether ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1) gene 69C/T single nucleotide polymorphisms variation was correlated with coronary heart disease(CHD) in Mongolian population of the Inner Mongolia region，and the association of this polymorphism with blood lipids. Methods The target fragments of ABCA1 gene was amplified and analyzed by polymerase chain reaction(PCR)-restriction fragments length polymorphism(RFLP) technique in 203 Mongolian patients with CHD and Mongolian control subjects without CHD. Results The frequency of TT genotype and T allele of ABCA1 69C/T gene was all significantly higher in CHD patients than that in controls(P<0.05). TT genotype adds ratio was 2.698 (95% CI：1.408 to 5.170，P<0.05).It showed that TT genotype was risk factorsfor CHD accidents by relative risk analysis. There was no significant difference in the levels of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C)，low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C)，cholesterol (TC)， triglycerides (TG) among three genotype of 69C/T (TT，TC，CC) gene (P>0.05).Conclusion ABCA1 gene 69C/T and polymorphism is associated with CHD risk in Mongolian population of the Inner Mongolia region.The TT genotype of the ABCA1 gene C69T polymorphism is associated with increased CHD risk.

coronary heart disease；ATP-binding cassette transporter A1；polymorphism；blood lipids

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(No.2013MS1131)

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(呼和浩特 010050)

劉曉宇，E-mail：p84zjj@163.com

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.002

1672-1349(2016)22-2597-04

2016-03-21)

引用信息：袁托亞，劉曉宇，王悅喜.內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群ABCA1基因69C/T多態(tài)性分布特點及其與血脂和冠心病的關(guān)系[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2597-2600.