TLR3-TBK1-IRF-3信號通路在EV71手足口病腦損傷中的機(jī)制研究

溫正旺 陳潔 金龍騰 陳益平 蔡曉紅 李昌崇

·臨床研究·

TLR3-TBK1-IRF-3信號通路在EV71手足口病腦損傷中的機(jī)制研究

溫正旺 陳潔 金龍騰 陳益平 蔡曉紅 李昌崇

目的探索干擾素TLR3-TBK1-IRF-3信號通路在EV71手足口病腦炎中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用機(jī)制。方法選取2014年1月至2015年1月手足口病患兒144例（觀察組）及健康體檢兒童36例（對照組），通過腦脊液檢查及臨床診斷，分成5組，正常兒童體檢組、普通手足口病兒童2d組（A組）、普通手足口病兒童5d組（B組）、手足口病腦炎2d組（C組）、手足口病腦炎5d組（D組），每組各36名兒童，用ELISA方法檢測患兒血液中TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF蛋白及干擾素的表達(dá)水平。結(jié)果觀察組干擾素的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組和C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組明顯高于D組（P＜0.01），A組與B組、D組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；觀察組TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF及蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組和C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組明顯高于D組（P＜0.01），B組高于A組（P＜0.01）、D組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論手足口病腦炎患兒干擾素及TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF蛋白的表達(dá)水平較正常兒童明顯升高，但比普通手足口病患兒較低，提示TLR3-TBK1-IRF-3信號通路對手足口病腦炎具有一定的診斷意義。

EV71 手足口病 腦炎 干擾素

手足口病是一種較為嚴(yán)重的傳染性疾病，主要好發(fā)于學(xué)齡前兒童，嚴(yán)重者可并發(fā)手足口病腦炎，這類患者中，絕大多數(shù)由EV71病毒感染引起。EV71如何導(dǎo)致手足口病腦炎的分子機(jī)制仍研究甚少，目前研究發(fā)現(xiàn)干擾素可以影響EV71手足口病腦炎的進(jìn)展及預(yù)后，干擾素在體內(nèi)主要包括產(chǎn)生和應(yīng)答機(jī)制，本課題將干擾素的產(chǎn)生機(jī)制作為一個(gè)切入點(diǎn)，從分子生物學(xué)機(jī)制上研究干擾素的產(chǎn)生信號通路對EV71手足口病腦炎的影響，為手足口病腦炎的及時(shí)診療及研究提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2015年6月本院手足口病患兒144例為觀察組，男72例，女72例；年齡6個(gè)月～3歲。均經(jīng)腦脊液、糞便EV71抗原檢查及臨床表現(xiàn)確診，排除合并其它疾病。依據(jù)病情及時(shí)間分成4組，手足口病患兒2d組（A組）、5d組（B組）；手足口病腦炎患兒2d組（C組）、5d組（D組），每組各36例。另選擇同期健康體檢兒童36例為對照組，男18例，女18例，年齡6月～3歲。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本課題中手足口病腦炎患兒經(jīng)過積極治療后，病情基本穩(wěn)定，住院后治愈出院，未出現(xiàn)轉(zhuǎn)為危重型的病例。

1.2 方法 采用Elisa法檢測各組中TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF及干擾素的蛋白表達(dá)（試劑盒由博士得公司提供），在每日清晨抽取各組的外周靜脈血1.5 ml，共5組，加入 24孔培養(yǎng)板中，每孔加入40μl 血，第1 孔加入生理鹽水作為基礎(chǔ)對照，第2、3、4、5、6 孔作陽性對照，加入植物血凝素（PHA）100μl，后5孔者分別用生理鹽水稀釋成 50g/ml，加入總量均為200μl，加入抗原后輕微搖動20s，37℃水浴中孵育時(shí)長16～20h，抽取血漿上清液適量，于-20℃冰箱冷凍備用，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。干擾素的釋放水平檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組正態(tài)計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（x±s）表示，用one-way ANOVA方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組干擾素的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組和C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組明顯高于D組（P＜0.01），B組高于A組（P＜0.01）、D組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組和C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組明顯高于D組（P＜0.01），B組高于A組（P＜0.01）、D組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組蛋白的表達(dá)水平比較（μg/mL）

3 討論

手足口病多發(fā)生于＜3歲兒童，在患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，預(yù)后差異性很大，個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡［1］。目前仍缺乏有效治療藥物，主要對癥治療。手足口病腦炎多是由腸道病毒感染引起，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，EV71、CA16、CVA4、CVA5、CVA9、CVA10、CVB1、CVB3和CVB5等9種病毒可引起手足口病［2］，其中EV71病毒是導(dǎo)致手足口病最常見的一種病毒，絕大多數(shù)的手足口病腦炎多由EV71病毒感染引起，2012年上海進(jìn)行一次手足口病高危因素的篩查中，EV71病毒感染更易誘發(fā)手足口病乃至手足口病腦炎［3］，目前對EV71病毒的檢測及EV71病毒感染的治療存在滯后性及缺乏針對性。有研究提示用EV71病毒感染小鼠的神經(jīng)細(xì)胞可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷，這些研究提示EV71攻擊性較強(qiáng)，在新生小鼠體內(nèi)如何導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，其病理生理機(jī)制尚未明確，本文將干擾素的產(chǎn)生機(jī)制作為研究EV71手足口病腦炎的研究靶點(diǎn)。

干擾素作為一類高活性多功能的糖蛋白，能誘導(dǎo)細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生抗性，它通過干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗腫瘤生物制品［4］。其可以分為I 型干擾素、II型干擾素和III 型干擾素三大類。IFN-Ⅰ中α、β和IFN-II具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤活性并且在病毒感染引起的免疫應(yīng)答中起重要的調(diào)節(jié)作用，長期作為有效的抗病毒與抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床，對其抗病毒、抗腫瘤機(jī)制的研究，一直是病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)。Lu等［5］研究認(rèn)為，在EV71感染后，TYK2的表達(dá)受到抑制，EV71感染可以通過抑制干擾素信號通路上相關(guān)因子的表達(dá)，從而對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷作用。

在臨床中對EV71感染的手足口病腦炎患兒使用干擾素制劑可以有效起到控制癥狀及減少住院時(shí)間的作用，如重組人干擾素等。在探討 EV71感染手足口病重癥患兒的免疫狀態(tài)時(shí)，通過ELISA方法檢測血清中干擾素的含量，發(fā)現(xiàn)相較于對照組，重癥組及普通組均有升高，但普通組升高更為明顯，各組之間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與本資料結(jié)果一致，提示重癥感染在一定程度上抑制了干擾素的表達(dá)［6］。

干擾素存在應(yīng)答及產(chǎn)生信號通路，主要通過它的產(chǎn)生信號通路發(fā)揮作用。在干擾素產(chǎn)生信號通路的上游，存在一種TLR3 受體，其是toll 樣受體中的一員，是病毒dsRNA識別受體，由于dsRNA是病毒復(fù)制過程中普遍存在的產(chǎn)物，因此 TLR3在宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［7］。當(dāng)病毒侵襲機(jī)體時(shí)，TLR3會出現(xiàn)明顯升高。在小鼠的單純皰疹病毒腦炎模型中，發(fā)現(xiàn)TLR3活化誘導(dǎo)的TNF-α過度表達(dá)，血腦屏障通透性增加，病毒直接進(jìn)入腦部，對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷［8］。TLR3是干擾素產(chǎn)生信號通路上的一個(gè)重要應(yīng)激因子，多數(shù)病毒感染都涉及到TLR3的表達(dá)，其中包括EV71病毒，它在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)［9］；尤其在神經(jīng)突觸細(xì)胞中表達(dá)最為豐富，主要功能是識別病毒感染并誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，作為干擾素產(chǎn)生信號通路的上游因子，TLR3可以影響下游信號因子的表達(dá)。

TLR3可以通過兩種途徑來產(chǎn)生干擾素，介導(dǎo)病毒感染對機(jī)體的影響。一種與NEMO基因相關(guān)，涉及到DsDNA，它是一種病原相關(guān)性受體模型，可以被TLR3識別，激活特定的轉(zhuǎn)化因子，從而誘導(dǎo)抗病毒基因的激活，被稱為基因途徑。另一種途徑是通過介導(dǎo)TRIF，TRIF最初被認(rèn)為是一種傳導(dǎo)來源于活化TLR3信號的蛋白，新近的研究肯定了這一作用，TRIF與TLR3均有一個(gè)共同的TIR（翻譯起始區(qū)），二者通過這個(gè)區(qū)域進(jìn)行信號傳遞，有研究提示敲除TRIF的TIR可以抑制TLR-3介導(dǎo)的信號傳遞［10］。TRIF蛋白缺乏或者缺失的小鼠在LPS作用下呈現(xiàn)出炎癥細(xì)胞因子生成障礙。另外有研究提示TBK1（NF-kB活化分子結(jié)合激酶-1）可以作為IRF-3的激酶，不僅與IRF-3、而且與TRIF連接，SAto等也發(fā)現(xiàn)TBK-1與TRIF-N端連接作用于IRF-3，其中IRF-3（干擾素調(diào)節(jié)因子-3）可以直接干預(yù)干擾素的生成［11］。在機(jī)體感染病毒后，干擾素I首先出現(xiàn)應(yīng)答，這是由于IFN-β的誘導(dǎo)，這個(gè)過程受到IRF-3的控制，TBK-1處于IRF-3的上游，激活后可刺激其活性［12］。本研究中發(fā)現(xiàn)在EV71手足口病及并發(fā)腦炎的患兒中TLR3-TBK1-IRF-3通路的表達(dá)水平明顯升高，存在時(shí)間依賴性，值得注意的是在手足口病腦炎患兒中，該通路的表達(dá)水平并未隨著發(fā)病時(shí)間的延長而升高，提示EV71病毒感染對該通路具有抑制作用，與先前的研究保持一致，提示TLR3-TBK1-IRF-3通路參與了EV71手足口病腦炎的發(fā)生發(fā)展過程。

［1］Tamura F, Chigira A, Ishii H, et al. Assessment of the development of hand and mouth coordination when taking food into the oral cavity. Int J Orofacial Myology,2000,26：33-43.

［2］Hu X M, Zhang Y, Xu B L, et al. Development of a GeXP based multiplex RT-PCR assay for simultaneous differentiation of nine human hand food mouth disease pathogens. Bing Du Xue Bao,2011,27(4)：331-336.

［3］Pan H, Zheng Y X, Mao S H, et al. A case-control study on risk factors that associated with severe hand-foot-mouth disease in Shanghai. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi,2012,33(8)：763-767.

［4］Hiramatsu N, Oze T, Takehara T. Suppression of hepatocellular carcinoma development in hepatitis C patients given interferonbased antiviral therapy. Hepatol Res,2014.

［5］Lu J, Yi L, Zhao J, et al. Enterovirus 71 disrupts interferon signaling by reducing the level of interferon receptor 1. J Virol,2012, 86(7)：3767-3776.

［6］王蓓. EV71拮抗I型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2013.

［7］Guo F, Mead J, Aliya N, et al. RO 90-7501 enhances TLR3 and RLR agonist induced antiviral response. PLoS One,2012, 7(10)：e42583.

［8］Klein K P, Tan L, Werkman W, et al. The role of Toll-like receptors in regulating the immune response against respiratory syncytial virus. Crit Rev Immunol,2009,29(6)：531-550.

［9］Pang L, Gong X, Liu N, et al. A polymorphism in melanoma differentiation-associated gene 5 may be a risk factor for enterovirus 71 infection. Clin Microbiol Infect,2014.

［10］Ahmed S, Maratha A, Butt A Q, et al. TRIF-mediated TLR3 and TLR4 signaling is negatively regulated by ADAM15. J Immunol, 2013, 190(5)：2217-2228.

［11］Sato S, Sugiyama M, Yamamoto M, et al. Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-beta(TRIF)associates with TNF receptor-associated factor 6 and TANK-binding kinase 1, and activates two distinct transcription factors, NF-kappa B and IFN-regulatory factor-3, in the Toll-like receptor signaling. J Immunol,2003,171(8)：4304-4310.

［12］Ehrhardt C, Kardinal C, Wurzer W J, et al. Rac1 and PAK1 are upstream of IKK-epsilon and TBK-1 in the viral activation of interferon regulatory factor-3. FEBS Lett,2004,567(2-3)：230-238.

ObjectiveTo investigate the role of TLR3-TBK1-IRF-3 signal pathway in EV71-induced encephalitis of hand food and mouth disease.MethodsThe study was conducted at second Affi liated Hospital and Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College from January 2014 to January 2015，based on blood examination，CSF routine test and clinical manifestation. There are 180 members and divided into fi ve groups，each group includes 36. 2day control group（2C），2day hand-food-mouth（2h），5day hand-food-mouth（5h），2day hand-food-mouth and encephalitis（2e），5day hand-food-mouth and encephalitis（5e）. Elisa and western blot were used to detect the expressions of certain signal pathway related proteins in blood.ResultsElisa assay：the levels of interferon，TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF protein expression in the groups of patients were signifi cantly increased than that of the corresponding control groups，（P＜0.01），especially the 5h group，there is no signifi cant difference found between 2e group and 2h group，it is the same between 2e and 5e group.Conclusions the levels of the levels of interferon，TLR3、TBK1、IRF-3、TRIFprotein expression in the groups of hand food mouth disease and encephalitis were signifi cant increased，but less expression than that groups of general hand food mouth disease，these suggest that TLR3-TBK1-IRF-3 signal pathway has a great role in the diagnosis of hand food mouth disease and encephalitis.

EV71 Hand-food-mouth disease Encephalitis Interferon

浙江省溫州市科技局（Y20140501）

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（育英兒童醫(yī)院）