肝素鈉對氟尿嘧啶誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷的影響探討

張鵬 吳蘭華 左曼 馬龍 王彥茹 蔣萍 林素蘭

(1.新疆醫科大學護理學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學第一臨床醫學院；3.新疆醫科大學基礎醫學院)

肝素鈉對氟尿嘧啶誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷的影響探討

張鵬1吳蘭華2左曼1馬龍1王彥茹1蔣萍3林素蘭1

(1.新疆醫科大學護理學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學第一臨床醫學院；3.新疆醫科大學基礎醫學院)

目的 通過觀察不同濃度肝素鈉對氟尿嘧啶誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷的影響，探討不同濃度肝素鈉稀釋液及不同作用時相點對氟尿嘧啶致血管內皮細胞損傷的影響及可能的作用機制。方法將體外培養的2～3代HUVECs隨機分為對照組、氟尿嘧啶組、肝素鈉組，其中對照組只用培養基培養；氟尿嘧啶組用終濃度為25 mg/L的氟尿嘧啶為刺激物；肝素鈉組分別以終濃度為12.5 U/mL、25 U/mL、50 U/mL肝素鈉稀釋液聯合終濃度為25 mg/L的氟尿嘧啶為刺激物。酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)及組織纖維溶酶原激活物(t-PA)含量。結果氟尿嘧啶組IL-6、IL-1及t-PA蛋白表達較對照組升高(P<0.05)；與氟尿嘧啶組相比，肝素鈉組可抑制氟尿嘧啶誘導的HUVECs 釋放 IL-6、IL-1及t-PA(P<0.05)，以50U/ mL肝素鈉組作用最為顯著，但IL-6、IL-1及t-PA蛋白表達仍高于對照組(P<0.05)。不同濃度肝素鈉組間差異無統計學意義(P>0.05)。同一藥物濃度組，與藥物作用1 d后相比，第4天、第7天、第14天均有統計學差異(P<0.05)，其中IL-6蛋白表達呈時間依賴性升高。結論肝素鈉可抑制內皮細胞釋放IL-1、IL-6及t-PA蛋白，對內皮細胞具有一定保護作用。

肝素鈉； 氟尿嘧啶； 人臍靜脈內皮細胞； 護理

經外周靜脈置入中心靜脈導管(Peripherally inserted central catheter，PICC)是惡性腫瘤患者化療的理想輸液通路。然而，留置針刺激可誘導內皮細胞凋亡，且隨著留置時間延長，內皮細胞凋亡數目逐漸增多，血管損傷加重，加之化療藥物刺激，更易導致靜脈炎。有文獻報道，留置時間、內皮細胞凋亡、血管損傷三者呈正相關[1]。大量臨床研究[2]表明，正確選擇封管液是減少中心靜脈置管后血管內皮細胞損傷、血栓形成和靜脈炎發生的關鍵。肝素鈉稀釋液是臨床最常用的封管液，但是最佳肝素鈉稀釋液濃度及不同時相點對血管內皮細胞化學性損傷的保護作用及其作用機制尚不明確。本課題通過體外實驗，探討不同濃度肝素鈉稀釋液及作用時相點對氟尿嘧啶致血管內皮細胞損傷的影響及可能的機制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、藥物及試劑 HUVECs細胞株購自江陰齊氏生物科技有限公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、雙抗均購自美國Hyclone。IL-1、IL-6及t-PA蛋白測定試劑盒均購自USCN。6孔板、96孔板購自美國康寧公司。氟尿嘧啶購自上海旭東海普藥業有限公司。肝素鈉購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀器 HF212UV二氧化碳培養箱，Thermo生物安全柜，Leica CTR6000倒置顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將細胞用含10%胎牛血清、5%青霉素/鏈霉素溶液(雙抗溶液)的M199培養液，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞長至80%～90%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3代用于實驗。選擇對數期生長的細胞，調整細胞濃度為1.0×105cells/mL,接種于96孔板中，每孔200 μL,每組設立3個復孔。待細胞生長至80%融合后，貼壁細胞隨機分為3組，倒置顯微鏡進行形態學觀察并攝片。

1.2.2 實驗分組

1.2.2.1 對照組 每孔加入200 μL的培養基。

1.2.2.2 氟尿嘧啶組 每孔加入200 μL氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基。

1.2.2.3 肝素鈉組 以肝素鈉與氟尿嘧啶共同孵育。(1)低濃度組：每孔加入200 μL肝素鈉濃度為12.5 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基。(2)中濃度組：每孔加入200 μL肝素鈉濃度為25 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基。(3)高濃度組：每孔加入200 μL肝素鈉濃度為50 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基。每組均孵育14 d，每隔24 h更換新鮮培養液，分別于第1天、第4天、第7天、第14天鏡下觀察細胞形態學改變并拍照，收集每個孔孵育了24 h的培養液，-80 ℃保存。

1.2.3 酶聯免疫吸附雙抗體夾心法 分別將IL-1、IL-6及t-PA標準品準確復溶，用稀釋液做1.25次倍比稀釋，IL-1標準品濃度分別為120 ng/L、80 ng/L、40 ng/L、20 ng/L、10 ng/L，IL-6標準品濃度分別為6 ng/L、4 ng/L、2 ng/L、1 ng/L、0.5 ng/L，t-PA標準品濃度分別為12 ng/L、8 ng/L、4 ng/L、2、1 ng/L。實驗其余步驟嚴格按IL-1、IL-6及t-PA蛋白測定試劑盒說明書操作。以450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線計算出相應的濃度。

2 結果

2.1 HUVECs形態觀察 (1)對照組：倒置顯微鏡下可見細胞呈不規則形，細胞單層融合時呈典型的“鋪路石”樣外觀，隨著培養時間增長，細胞數目成“S”形曲線生長。(2)氟尿嘧啶組：細胞培養初期可觀察到細胞生長受到抑制，細胞培養至第10天時，倒置顯微鏡下可見多數細胞死亡，培養至第14天時，細胞全部死亡。(3)肝素鈉組：細胞數目增長較慢，細胞不出現融合，50 U/mL肝素鈉加25 mg/L氟尿嘧啶組細胞生長相對較好，與其他濃度組相比，細胞數目較多且細胞形態相對完整。

2.2 不同濃度肝素鈉對氟尿嘧啶誘導HUVECs分泌IL-1、t-PA及IL-6的影響 對照組HUVECs釋放少量IL-1、IL-6及t-PA，氟尿嘧啶25 mg/L刺激后，其IL-1、IL-6及t-PA蛋白表達明顯增加，經不同濃度肝素鈉干預后，其上清液IL-1、IL-6及t-PA蛋白含量下降，以高濃度肝素鈉組(50 U/mL肝素鈉稀釋液加25 mg/L氟尿嘧啶)作用為著，但仍高于對照組。五組間IL-1含量比較，差異有統計學意義(F=41.055，P<0.01);五組間t-PA含量比較，差異有統計學意義(F=64.516，P<0.01);五組間IL-6含量比較，差異有統計學意義(F=13.091，P<0.01)。見表1。

表1 不同組人臍靜脈內皮細胞表達IL-1、IL-6及t-PA的含量比較 (ng/L)

注：與對照組相比，*P<0.05;與氟尿嘧啶組相比，#P<0.05。

3.3 肝素鈉在不同時相點對HUVECs釋放IL-1、IL-6及t-PA蛋白的影響 以50 U/mL肝素鈉稀釋液與25 mg/L氟尿嘧啶共同孵育14 d，分別于第1天、第4天、第7天、第14天取24 h培養液，可見隨著時間的延長，上清液的IL-1、IL-6及t-PA增高， 14 d達到高峰，且在4、7、14 d各時相點均高于對照組，IL-1、t-PA在第7天與第4天無統計學差異(P>0.05),第14天與第7天有統計學差異(P<0.05);IL-6四個時間點均有統計學意義(F=142.518，P<0.05)。見表2～4。

ng/L

注：與1 d相比，*P<0.01；與4 d相比，#P<0.01；與7 d相比，△P<0.01。

ng/L

注：與1 d相比，*P<0.01；與4 d相比，#P<0.01；與7 d相比，△P<0.01。

ng/L

注：與1 d相比，*P<0.01；與4 d相比，#P<0.01；與7 d相比，△P<0.01。

3 討論

PICC已經成為腫瘤患者治療的重要用藥通路。然而PICC置管后可導致導管脫出、導管阻塞、血管壁機械性損傷，加之化療藥物的應用，可使血管上皮細胞壞死[3]，更易導致靜脈炎。一項臨床的隨機整群對照研究結果顯示：使用3 mL的100 U/mL的肝素溶液沖管比生理鹽水沖洗外周靜脈套管更有效，原因在于它減少了外周靜脈置管后發生靜脈炎、堵管、更換置管位置的次數[4]。但是，也有學者認為，低分子肝素具有保護血管內皮的作用，從而在某種程度上可以減輕高凝狀態及炎癥播散[5]。目前大量的臨床和實驗研究表明肝素也具有抗炎活性[6]。多項研究表明[7]，肝素抑制促炎因子的釋放,包括IL-1β、IL-6、TNF-α、抑制缺血再灌注損傷中NF-κB介導的炎癥反應,并通過增加一氧化氮和前列環素的生成減少了內皮細胞功能障礙。本次研究通過檢測促炎因子IL-6、IL-1及t-PA的含量，探討不同濃度肝素鈉稀釋液及作用時相點對氟尿嘧啶致血管內皮細胞損傷的影響。

本研究結果表明：以不同濃度肝素鈉干預氟尿嘧啶作用后的HUVECs，各濃度肝素鈉組IL-1、IL-6及t-PA蛋白表達與氟尿嘧啶組比較有顯著差異；不同濃度肝素鈉組間差異無統計學意義，其中濃度為50 U/mL為主，說明不同濃度肝素鈉對氟尿嘧啶誘導HUVECs損傷均具有保護作用，但不同濃度對其影響甚微。同時也印證了夏瑾[8]不同劑量肝素鈉無統計學差異，且對無肝素鈉使用禁忌的患者用50 U/mL肝素鈉封管效果最好的觀點。同一藥物濃度組，與藥物作用1 d后相比，第4天、第7天、第14天均有統計學差異，其中IL-6蛋白表達在一定范圍內呈時間依賴性升高，在第14天時，肝素鈉組IL-6、IL-1及t-PA的含量遠遠低于氟尿嘧啶組，提示肝素鈉在第14天時仍具有保護內皮細胞的作用，相對延長置管時間。但由于體外實驗，細胞存活時間有限，研究至14 d后細胞幾乎全部死亡，后期將通過在體實驗，進一步研究。

綜上所述，肝素鈉對氟尿嘧啶誘導HUVECs損傷具有一定保護作用，其機制可能是肝素鈉抑制氟尿嘧啶誘導HUVECs分泌IL-1、IL-6等炎性因子。在離體實驗中，不同濃度肝素鈉均有保護內皮細胞的作用，以50 U/mL肝素鈉為著，其相對延長了置管時間。本研究結果為臨床上肝素鈉封管液濃度的選擇及封管時間提供了實驗依據。

[1] 路雪芹，陳傳波，陳海燕，等.留置針留置不同時間致血管內皮細胞損傷的病理變化[J].解剖學雜志,2012,35(3)：293-296.

[2] 王建榮，李冰.經外周靜脈中心靜脈導管應用現狀及研究進展[J].中國護理管理，2009, 9(2): 10-14.

[3] 穆桂梅，陳紅梅.腫瘤患者外周穿刺中心靜脈置管致機械性靜脈炎的原因分析與護理對策[J].黑龍江醫學,2011,35(7)：551-552.

[4] Bertolino, Giampiera，Pitassi. Intermittent flushing with heparin versus saline for maintenance of Peripheral Intravenous catheters in a medical department: A pragmatic cluster-randomized controlled study[J]. Worldviews on Evidence-based Nursing, 2012，9(4):221-226.

[5] 孫妮娜，程兆忠，韓偉忠，等.低分子肝素對慢性阻塞性肺病大鼠血管內皮的影響[C].中華醫學會呼吸病學年會，2011：433.

[6] Shastri MD, Johns C, Hutchinson JP, et al. Ion exchange chromatographic separation and isolation of oligosaccharides of intact low-molecular-weight heparin for the determination of their anticoagulant and anti-inflammatory properties[J]. Anal Bioanal Chem, 2013，405(18):6043-6052.

[7] 李旭.肝素在脂多糖誘導急性損傷大鼠血管內皮細胞損傷中的抗炎作用及其機制研究[D].北京：中國醫科大學，2011.

[8] 夏瑾.不同劑量肝素封管液對老年患者靜脈留置針通暢情況影響的研究[J].檢驗醫學與臨床，2009，6(8)：572-573.

The influence of heparin sodium for fluorouracil-based induction of human umbilical vein endothelial cells damage

Zhang Peng1, Wu Lanhua2, Zuo Man1,Ma long，Wang Yanru1, Jiang Ping3, Lin Sulan1

(1.CollegeofNursingofXinjiangMedicalUniversity; 2.TheFirstClinicalMedicalCollegeofXinjiangMedicalUniversity;3.SchoolofBasicMedicalSciencesofXinjiangMedicalUniversity,UrumqiXinjiang830000 )

Objective To detect the mechanism on the effects of different level of heparin sodium on fluorouracil induced expression of interleukin 6 (IL-6) and interleukin 1 (IL-1), tissue fiber dissolving enzyme activators (t-PA), in induction of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods Cultured HUVECs at passage 3 to 6 was randomly divided into control group, fluorouracil group and heparin sodium group, with a final concentration of fluorouracil group is 25 mg/L of fluorouracil for stimulus, heparin sodium group on final concentration of 12.5, 25, 50 μ/ml sodium heparin dilution and the final concentration of 25 mg/L of fluorouracil for stimulus. The protein level of IL-6, IL-1 and t-PA in the cultured medium were measured by enzyme-linked immunosorbent (ELISA).Results Compared to control group, the expression of IL-6, IL-1, t-PA protein increased in fluorouracil group (allP<0.05). Compared to fluorouracil group，heparin can inhibit HUVECs induced by fluorouracil release IL-6, IL-1 and t-PA (P<0.05), with 50 u/ml role for the heparin group, but IL-6, IL-1 and t-PA protein expression is still higher than that of the control group (P<0.05). There was no statistical difference between different concentrations of sodium heparin group (P>0.05). The same drug concentration group, compared with the drug effect after 1 days, 4 days, 7 days, 14 days are statistically significant difference (P<0.05). IL-6 protein expression in time dependence.Conclusion Heparin group inhibits endothelial cells release, IL-6 and IL-1 t-PA protein, possesses certain protective effects on endothelial cells.

Heparin sodium; Fluorouracil; HUVECs； Nursing

2014年新疆維吾爾族自治區級大學生創新項目(編號：CX2014032)

張鵬(1993-)，女，河北，本科，研究方向：腫瘤護理

林素蘭，E-mail：linsulan@163.com

R471

A

10.16821/j.cnki.hsjx.2016.03.005

2015-09-31)