YB—1在低氧微環境誘導的宮頸癌EMT中的作用及機制研究

摘要：目的 探討Y-盒結合蛋白-1（Y-box binding protein-1，YB-1）在低氧誘導的宮頸癌上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發生中的作用及可能機制，為研究宮頸癌浸潤轉移機制提供理論依據。方法 應用二氯化鈷（CoCl2）處理宮頸癌Hela細胞模擬細胞低氧微環境，MTT 法檢測細胞的增殖活力，篩選CoCl2最適作用濃度及時間；倒置顯微鏡觀察低氧6 h后細胞形態特征；細胞免疫熒光法檢測低氧6 h后細胞中YB-1、Vimentin和MMP-2的蛋白表達及其相互關系。結果 模擬低氧微環境的CoCl2最適作用濃度為150 μmol/L，最適作用時間為6 h（P<0.05）；低氧使Hela細胞逐漸獲得了間質細胞的形態特征；低氧6 h后，Hela細胞中YB-1、Vimentin、MMP-2表達較常氧組顯著增高（P<0.05），且YB-1、Vimentin、MMP-2之間相互呈正相關（P<0.05）。結論 YB-1可能通過YB-1-MMP-2-Vimentin途徑，上調Vimentin表達從而在低氧誘導的宮頸癌EMT發生中起到關鍵作用。

關鍵詞：Y-盒結合蛋白-1；上皮間質轉化；宮頸癌；低氧微環境

中圖分類號：R737.33 文獻標識碼：A

宮頸癌是涉及多因素、多基因共同作用的婦科常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率均居女性腫瘤第二位[1]。盡管宮頸癌篩查不斷普及，但仍有大量未經篩查的中晚期患者因腫瘤的浸潤、轉移及對放化療耐藥，從而導致患者不良預后或死亡。近年研究表明，EMT是具有極性的上皮細胞轉變成具有活動能力的間質細胞的過程，是多種腫瘤侵襲轉移的重要環節[2]。目前體內、外實驗均已證實，EMT在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和宮頸癌等多種腫瘤的浸潤和轉移中起著重要的作用[3]。 因此，研究EMT與宮頸癌的關系及其調控機制，對尋找治療宮頸癌浸潤及轉移的目標靶點有著重要的意義。

1資料與方法

1.1細胞株和主要試劑 宮頸癌Hela細胞由昆明醫科大學云南省藥理重點實驗室周軼平老師饋贈。CoCl2購自廣州金華大化學試劑有限公司；DMSO 、DAPI、兔抗人YB-1多克隆抗體購自碧云天生物技術研究所；單克隆小鼠抗人Vimentin、兔抗人MMP-2單克隆抗體購自武漢博士德生物公司；山羊抗兔-TRITC、山羊抗小鼠-FITC購自康為世紀。

1.2細胞培養 Hela細胞置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養箱內培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測CoCl2對Hela細胞活力的影響

1.3.1 MTT法檢測CoCl2不同濃度對Hela細胞增殖活力的影響 Hela細胞接 種于96孔板，加含CoCl2（0、50、100、150、200、250 μmol/L）的培養基，6 h加MTT，4 h加DMSO，振蕩、酶標儀測量OD值，計算細胞存活率。

1.3.2MTT法檢測CoCl2不同時間對Hela細胞增殖活力的影響 Hela細胞接種于96孔板，0、3、6、12、24 h加入含150 μmol/LCoCl2的培養基，6 h加MTT 4 h加DMSO，振蕩、酶標儀測量OD值，計算細胞存活率。

1.4低氧對Hela細胞形態學的影響 分低氧組、常氧組，低氧組用含終濃度為150 μmol/L的CoCl2溶液的培養基，常氧組用正常培養基培養，處理6 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，鏡檢、拍照。

1.5免疫熒光法檢測低氧對Hela細胞YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表達的影響 制備細胞爬片、固定、血清封閉、分別滴加YB-1、Vimentin、MMP-2、YB-1與Vimentin、YB-1與MMP-2混合一抗（1∶100），4℃過夜后分別滴加相應的熒光標記二抗，室溫避光孵育、DAPI工作液染核、封片，觀察、拍照。

1.6 統計學分析 計量資料以（x±s）表示，應用SPSS17.0軟件對數據進行t檢驗；相關分析采用Pearson線性相關，P<0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1低氧對Hela細胞增殖的影響 MTT結果顯示，以50、100、150、200、250 μmol/L 的CoCl2 處理Hela細胞6 h 后，細胞存活率分別為（117±16）%、（103±13）%、（96±17）%、（66±16）%、（55±16）%。CoCl2 對Hela 細胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴性，與未加用CoCl2的細胞相比，CoCl2濃度為150 μmol/L時顯示顯著的細胞抑制作用。用含150 μmol/L的 CoCl2培養基處理Hela細胞3 h、6 h、12 h、24 h后細胞的存活率分別為（109±11.9）%、（103±6.5）%、（88±4.7）%、（69±14.5）%，表明CoCl2作用時間越長，細胞存活率越低，與0 h相比，作用后6 h細胞存活率顯著下降（P<0.05）。表明CoCl2 對Hela 細胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度-時間依賴性。根據實驗結果及參考文獻，選擇150 μmol/L的CoCl2、作用6 h作為低氧組培養條件用于后續實驗。

2.2低氧對Hela細胞形態學的影響 濃度為150 μmol/L的CoCl2溶液刺激Hela細胞6 h后發現，Hela細胞獲得了間質細胞形態特征，大部分細胞逐漸伸展、變形，細胞間空隙變寬，突起變得更為狹長，見圖1。

圖1 150 μmol /L CoCl2處理6h后細胞形態的變化

（倒置顯微鏡×100）

2.3低氧對Hela細胞YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表達的影響 熒光顯微鏡下觀察，YB-1陽性表達呈紅色熒光，主要定位在胞核或胞漿內，胞核為主。Vimentin的陽性表達呈綠色熒光，定位在細胞質。MMP-2陽性表達呈綠色熒光，主要定位于細胞質或細胞膜。與常氧組比較，低氧組Hela細胞中YB-1、MMP-2、Vimentin蛋白的表達顯著增高（P<0.05）。雙重熒光法同時檢測Hela細胞中YB-1與MMP-2及YB-1與Vimentin蛋白表達，Pearson相關分析發現低氧狀態下YB-1、MMP-2、Vimentin蛋白表達兩兩呈正相關（P<0.05），見圖2，表1，表2。

單標法 雙標法

圖2 低氧對Hela細胞YB-1、MMP-2、Vimentin的表達影響（單、雙標法）（×200）

3討論

腫瘤細胞的侵襲轉移包括粘附性下調、基質降解、遷移性增強3個關鍵環節，目前研究認為EMT是腫瘤轉移早期始動的關鍵步驟[4]，與腫瘤浸潤、轉移和耐藥密切相關。

本實驗中MTT結果表明CoCl2 對Hela 細胞的增殖具有抑制作用，同時發現CoCl2可導致Hela細胞發生了明顯的間質細胞形態學的改變，說明低氧可誘導宮頸癌細胞發生EMT，免疫熒光檢測發現低氧狀態下宮頸癌Hela細胞中Vimentin表達明顯增強，Vimentin作為間質細胞的主要細胞骨架成分之一，參與調解細胞的運動和增殖，是EMT的標志，低氧組宮頸癌Hela細胞Vimentin表達增高，提示低氧狀態下宮頸癌細胞確實發生了EMT。

本實驗通過免疫熒光染色法檢測了宮頸癌Hela細胞MMP-2蛋白的表達情況，發現與常氧組比較，低氧組宮頸癌Hela細胞中MMP-2表達明顯增強，同時還發現低氧組宮頸癌Hela細胞YB-1、MMP-2、Vimentin兩兩呈正相關。提示低氧誘導宮頸癌細胞發生EMT時YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表達上調。因此，YB-1可能通過YB-1-MMP-2-Vimentin途徑，上調Vimentin表達從而在低氧誘導的宮頸癌EMT發生中起到關鍵作用。

參考文獻：

[1]李霓，鄭榮壽，張思維，等.2003～2007年中國宮頸癌發病與死亡分析 [J].中國腫瘤，2012，21（11）：801-804.

[2]Polyak K，Weinberg RA.Transitions between epithelial and mesenchymal states：Acquisition of malignant and stem cell traits[J]. Nature Rev Cancer，2009，9（4）：265-273.

[3]Thiery JP，Lim CT.Tumor Dissemination： An EMT Affair[J].Cancer Cell，2013，23（3）：272-273.

[4]Lee MY，Shen MR，Epithelial-mesenchymal transition in cervical carcinoma[J].Am J Translational Res， 2012，4（1）：1.

[5]Cobbold LC，Wilson LA， et al. Upregulated -c-myc expression in multiple myeloma by internal ribosome entry results from increased interactions with and expression of PTB-1 and YB-1[J].Oncogene， 2010，29（19）：2884-2891.

編輯/申磊