漢防己甲素對鈦顆粒刺激PBMC表達(dá)HMGB1的研究

摘要：目的 探討漢防己甲素對鈦顆粒刺激人血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）釋放HMGB1的影響，為臨床提供防治人工膝關(guān)節(jié)無菌松動(dòng)提供證據(jù)。方法 將按照密度梯度方法提純?nèi)搜獑蝹€(gè)核細(xì)胞分為四組，1組為陰性對照組：不做任何處理；2組為陽性對照組：PBMC+0.1%鈦顆粒；3組為低濃度漢防己甲素組：PBMC+0.1%鈦顆粒+漢防己甲素1g/ml；4組為高濃度漢防己甲素組：PBMC+0.1%鈦顆粒+漢防己甲素10 g/ml；培養(yǎng)48h后，應(yīng)用ELISA和RT-PCR方法分別檢測上清液中HMGB1濃度和人血單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1mRNA的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS軟件分析a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果 ①鈦顆粒刺激PBMC表達(dá)HMGB1蛋白及HMGB1mRNA含量明顯升高：1、2組HMGB1蛋白含量分別為16.34 1.63ng/ml、63.13 2.73ng/ml，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2600.42，P<0.01）；HMGB1mRN含量分別為0.19 0.03、0.78 0.07，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=516.55，P<0.01）；②漢防己甲素對受鈦顆粒刺激后單核細(xì)胞釋放HMGB1及HMGB1mRNA含量的影響：3、4兩組與2組釋放HMGB1存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=600.57，2621.29，P<0.01），HMGB1mRNA含量（F=250.18，288.59，P<0.01）；與1組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2153.03，1177.804，P<0.01）HMGB1mRNA含量（F=276.39，184.62，P<0.01）。結(jié)論 人工關(guān)節(jié)假體磨損顆粒可通過上調(diào)單核細(xì)胞HMGB1mRNA的表達(dá)及HMGB1的釋放，促進(jìn)假體周圍炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致假體無菌性松動(dòng)；防漢己甲素通過抑制單核細(xì)胞HMGB1的釋放及合成可能防治人工關(guān)節(jié)無菌松動(dòng)。

關(guān)鍵詞：漢防己甲素；鈦顆粒；單個(gè)核細(xì)胞；高遷移率族蛋白-1

Study on the Expression of HMGB1 in PBMC Stimulated by Tetrandrine on Titanium Particles

ZHAO Li，MA Xing-juan，ZHAO Jing

（The First Hospital of Handan，Handan 056002，Hebei，China）

Abstract：Objective The release of HMGB1 of Tetrandrine n on titanium particles stimulate blood mononuclear cell （PBMC） was approached，to supply documentation for prevention artificial knee joint aseptic loosening. Methods The cells were divided into 4 groups ，cells in group 1 were added with nothing， while cells in group 2，3，and 4 were added with titanium particles（0.1%），and the cells in group 3，4 were added with Tetrandrine （1 g/ml，10 g/ml）.The contents of HMGB1 protein and HMGB1Mrna of the 4 groups were respectively detected through enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）and polymerase chain reaction（PCR） after culturing for 48 hours. Results ①Effect of titanium particles suspension concentration on HMGB1expression： There were statistical differences in the contents of HMGB1 protein and HMGB1 m RNA of macrophages among the 2 groups（F=2600.42，P<0.01； F=516.55，P<0.01）.② Effect of titanium particles and Tetrandrine on the expression of HMGB1 protein and HMGB1 m RNA ： There were statistical differences in the contents of HMGB1 protein and HMGB1 m RNA of macrophages among the 2 group and 3/4 group（F=17.73，P<0.01； F=723.45，P<0.01）； There were statistical differences among the 1 group and 3/4 group（F=2153.03，P<0.01； F=1177.804，P<0.01）.Conclusion Wear particles from joint prosthesis can up-regulate the expression of HMGB1 ，which leads to bone absorption and osteolysis. Tetrandrine could realsed the expression of HMGB1， which would be used to patients for prevention artificial knee joint aseptic loosening.

Key words：Tetrandrine；titanium particles；PBMC；HMGB1

人工關(guān)節(jié)假體磨損顆粒誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)可促進(jìn)假體周圍骨吸收、溶解，是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體無菌性松動(dòng)的主要原因之一[1]。高遷移率族蛋白1（high mobility group protein，HMGB1）可以啟動(dòng)天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，參與膿毒癥、關(guān)節(jié)炎等多種疾病過程，但HMGB1與人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的關(guān)系，尚無明確研究結(jié)果。漢防己甲素又稱粉防己堿，是從中藥漢防己的根塊中提取的一種生物堿，其可通過抑制T淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等免疫炎癥細(xì)胞的增殖和激活從而抑制炎癥反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)漢防己甲素明顯抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)展且作用強(qiáng)于阿司匹林[2]，但漢防己甲素是否通過抑制HMGB1的合成和釋放以抑制假體松動(dòng)時(shí)的無菌性炎癥反應(yīng)，目前尚無研究。本研究通過鈦顆粒刺激單個(gè)核細(xì)胞模仿人工關(guān)節(jié)局部環(huán)境為研究對象，探討漢防己甲素對鈦顆粒刺激單個(gè)核細(xì)胞HMGB1釋放和合成的影響。

1 材料與方法

1.1材料 采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。淋巴細(xì)胞分離液，10%小牛血清RPMI1640，Hank s液，鈦顆粒（Alfa Aesar公司），HMGB1酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、Trizol Reagent總RNA提取試劑（北京德博生物有限公司），漢防己甲素（臨汾藥業(yè)有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 DHC-1300-RA-BR超凈工作臺（蘇州凈化公司），PCR儀（BD公司）。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞分離及活力檢測 將采用 Ficoll密度梯度離心法獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞加入5倍以上體積的Hank s液，1500rpm×10min，洗滌細(xì)胞兩次，末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞，取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2%臺盼藍(lán)染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)計(jì)細(xì)胞活力檢測，活細(xì)胞百分率在95%以上。

1.3.2鈦顆粒懸液配制 將鈦顆粒用乙醇浸泡消毒后，用無菌PBS配成濃度為0.1%的懸液，用鱟試劑證實(shí)無內(nèi)毒素后儲存在4℃冰箱備用。

1.3.3外周血單個(gè)核細(xì)胞的HMGB1的RT-PCR檢測 嚴(yán)格按照說明書提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的DNA，由上海生工合成HMGB1的引物及管家基因Actin的引物。HMGB1的上游引物：5 -AGATC CTAAG AAGCC GAGAG-3，下游引物：5-GGCTG ACAAG GCTCG TTATG-3。管家基因Actin引物序列：上游引物5-CCCAG AGCAA GAGAGGCATCC-3，下游引物5-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3。反應(yīng)條件：42℃1h后，95℃熱變性5min，RT反應(yīng)后得到產(chǎn)物長度為269bp，應(yīng)用photoshop7軟件檢測HMGB1mRNA的條帶強(qiáng)度多為表達(dá)數(shù)值。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1鈦顆粒對HMGB1表達(dá)的影響 將細(xì)胞分為兩組，1組不做任何處理，2組加入濃度為0.1%的鈦顆粒，培養(yǎng)48h后采用ELISA和RT-PCR方法檢測兩組的HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的含量。

1.4.2不同濃度漢防己甲素對鈦顆粒刺激PBMC表達(dá)HMGB1的影響 將加入濃度為0.1%鈦顆粒的細(xì)胞分為兩組，3組加入漢防己甲素1g/ml，4組加入漢防己甲素10g/ml，培養(yǎng)48h后采用ELISA和RT-PCR方法檢測兩組的HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，1～6組外周血單個(gè)核細(xì)胞HMGB1及HMGB1mRNA含量的組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1鈦顆粒對HMGB1表達(dá)的影響 1組和2組單個(gè)核細(xì)胞HMGB1蛋白和HMGB1mRNA含量的組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組HMGB1蛋白含量比較（F=2600.42，P<0.01）；兩組HMGB1mRNA含量比較（F=516.55，P<0.01）.

2.2不同濃度漢防己甲素對鈦顆粒刺激PBMC表達(dá)HMGB1的影響 加入不同濃度漢防己甲素兩組（3、4組）和鈦顆粒組（2組）刺激PBMC表達(dá)的HMGB1及HMGB1mRNA含量的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中HMGB1含量的比較：3、4組的表達(dá)均低于2組（F***=600.57，F(xiàn)****=2621.29，P<0.01）；3、4兩組表達(dá)高于1組（F*=100.31， F**=15.88，P<0.01）。HMGB1mRNA含量：3、4組表達(dá)低于2組（F***=250.18， F****=288.59，P<0.01）； 3、4組高于1組（F*=276.39， F**=184.62，P<0.01）；3組HMGB1蛋白及HMGB1mRNA含量均高于4組（FHMGB1=69.64，P<0.01； FHMGB1m RNA=6.05，0.01

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療包括髖、膝、肩、肘、踝關(guān)節(jié)等嚴(yán)重關(guān)節(jié)疾病的有效手段，但假體磨損、松動(dòng)、甚至斷裂等并發(fā)癥現(xiàn)在已成為抑制關(guān)節(jié)置換術(shù)發(fā)展的瓶頸。調(diào)查發(fā)現(xiàn)人工關(guān)節(jié)假體松動(dòng)居于并發(fā)癥的首位[3]，人工關(guān)節(jié)假體磨損顆粒誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)可促進(jìn)假體周圍骨吸收、溶解，是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體無菌性松動(dòng)的主要原因之一。目前體外實(shí)驗(yàn)研究常選用鈦顆粒作為假體磨損顆粒來研究[4]。

細(xì)胞外的HMGB1是重要的致炎介質(zhì)，作為組織損傷信號[5]，刺激單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的活化和增殖，誘導(dǎo)這些免疫炎癥細(xì)胞釋放多種炎性因子[6]。本研究顯示，鈦顆粒刺激人單個(gè)核細(xì)胞后，上清液中檢測HMGB1蛋白含量增加（F=2600.42，P<0.01），單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1mRNA表達(dá)增加（F=516.55，P<0.01），證實(shí)鈦顆粒可通過刺激單個(gè)核細(xì)胞合成和釋放HMGB1引起炎性因子釋放。

漢防己甲素又稱粉防己堿，是從中藥漢防己的根塊中提取的一種生物堿，具有消炎、鎮(zhèn)痛、降壓、降血糖、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)和抗自由基損傷等多種藥理作用，臨床常用在抗肝纖維化和抗腫瘤等方面。本研究也顯示通過將不同濃度的漢防己甲素加入鈦顆粒刺激的人單個(gè)核細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)漢防己甲素均可抑制HMGB1的釋放和合成（F***=600.57，F(xiàn)****=2621.29，P<0.01），且這種抑制作用具有劑量依賴性（FHMGB1=69.64，P<0.01；FHMGB1m RNA=6.05，0.01

HMGB1作為一種炎癥介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子，已成為近年危重醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。因其為啟動(dòng)和維持炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)的中心分子，具有較寬的治療窗口，是目前抗炎治療的靶向目標(biāo)。本研究顯示漢防己甲素作為具有抑制炎癥反應(yīng)的中藥，可明顯抑制鈦顆粒刺激人單個(gè)核細(xì)胞合成和釋放HMGB1，從而抑制鈦顆粒刺激引起的炎癥反應(yīng)，因此漢防己甲素在防治關(guān)節(jié)假體松動(dòng)等慢性炎癥疾病方面具有遠(yuǎn)大的前景。

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編輯/成森