淺析免疫組化技術

免疫組織化學簡稱免疫組化，又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質，免疫組化技術近年來得到迅速發展。病理診斷如果應用的是免疫熒光法，則必須要具備熒光顯微鏡，而熒光的強會因為時間的增長而慢慢消退，要長期保存結果非常難。也正是因為如此，推廣應用受到了較大的限制。免疫酶法逐漸將其取代。在已知的抗原分子或者是抗體上標記熒光素。如果相應的抗體或者是抗原發生反應，那么由此而產生的復合物上就會有熒光素的存在。使用熒光顯微鏡可以很容易看見熒光和抗原體相結合的部位，將抗體或者是抗原測出。

1 免疫熒光法

按照抗原抗體反應的結合步聚，免疫熒光法可分以下3種。

1.1直接法 用熒光素標記的特異性抗體直接與相應的抗原結合，以檢查出相應的抗原成分。

1.2間接法 先用特異性抗體與相應的抗原結合，洗去未結合的抗體，再用熒光素標記的抗特異性抗體（間接熒光抗體）與特異性抗體相結合，形成抗原一特異性抗體一間接熒光抗體的復合物。

1.3補體法 用具有特異性的的補體以及抗體的混合液使其與標本上的抗原產生反應。補體會出現在原抗體的復合物上，再使用抗補體中的熒光抗體與其進行結合，獲得\"抗原一抗體一補體一抗補體熒光抗體\"的復合物。

優點：酶反應產物呈現的顏色能在一般的普通生物顯微鏡下觀察，其產物因具有一定電子密度也可在電鏡下觀察.標本能長期保存并能加HE染色等其他復染，有利于將被檢測物質與病變的形態學改變聯系起來（定性與定位）酶的選擇；從理論的角度來說講，采用細胞化學的方法能夠被顯出出來的酶，幾乎都可以用來標記抗體實現免疫酶法染色，而在實際的應用當中，可以被用于免疫組織化學技術的酶沒有很多。

可用于標記的酶應具備：酶催化的底物必需是特異的，而且容易 被顯示反應的終產物所形成的沉淀必須穩定即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，而影響組織學定位，較易獲得純的酶分子中性PH值時，酶分子應穩定在酶標過程中，酶連接在抗體上，不能影響二者的活性檢組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似的物質，否則結果將難以判定符合上述要求的。最為常用的酶是辣根過氧化物酶其次是堿性磷酸酶，除此兩種外，還有葡萄糖氧化酶等，但因其形成的不溶性色素擴散作用較大，在應用上受到很大限制。

2 免疫組織化學方法

是一種把分子水平的物質準確具體表達出來的一種方法，在常規病理診斷中，可借助于免疫組化來輔助診斷，歸納起來，有以下8個方面。

2.1腫瘤的組織起源方面進行鑒別診斷 免疫組織化學在確定組織起源中的應用是無限的。免疫組化技術是一個復雜的生物技術，對每一個抗體標記物都有獨自特定的染色方法，目的是能夠明確各種組織起源，判定組織中是否存在特異抗原。

2.2發現微小轉移灶，腫瘤生長活躍程度的綜合判斷。激素受體的檢測以指導臨床治療乳腺癌ER、PR的檢測。乳腺癌細胞中雌激素表達陽性，患者可以進行三苯氧胺的治療，雌激素能夠促進乳腺癌細胞的生長，三苯氧胺有封閉癌細胞中雌激素受體的功能，免疫組織化學測定雌激素受體的表達情況，可以預測三苯氧胺治療的意義。

2.3雌激素陰性赫賽汀治療。

2.4胃腸道間質瘤用格列衛治療胃腸道間質瘤CD117的。

2.5檢測激素類細胞的定位和定性以進一步明確內分泌細胞的類型和功能狀態，如垂體瘤、胰島細胞瘤、類癌等。

2.6指導腫瘤分期 通過免疫組化清楚顯示腫瘤對基底膜、血管的浸潤，從而獲得準確的分期。指導腫瘤預后的判斷如目前開展的癌基因的免疫組化檢測，瘤細胞抗藥性的檢測等免疫性疾病的輔助診斷如腎小球腎炎、某些皮膚疾病等對組織內免疫球蛋白、補體、免疫復合物的檢測。

2.7免疫組化標記具有形態學特點，若能熟練掌握則有助于對免疫組化標記結果的正確判斷。

2.8根據陽性標記的顯色程度分為：淡黃色，提示弱陽性；棕黃色，為中等強度；棕黑色，示為強陽性。在結果判斷中，后兩者較有意義，可作為判讀依據。而前者除考慮標本處理和方法學因素外，可能與細胞只有輕度異常表達，或某些細胞攝取了周圍組織抗原之故。

在標記免疫組化中，陽性標記細胞學特征是要將抗原在細胞里的分布以及定位情況反映出來。擬標記的細胞是診斷中陽性細胞的前提。陽性表達的實現要在細胞某個特定的抗原地方。否則不能把陽性當作主要的判斷依據。

3 類型

根據抗原在細胞中分布和陽性顆粒沉淀部位可分為以下5種類型。

3.1胞膜型 陽性顆粒主要分布于細胞膜表面，形成一薄層棕黃色顆粒包繞整個細胞。此類型常見于某些膜抗原，如上皮膜抗原（EMA）、白細胞共同抗原（LCA）及B細胞、T細胞、C-erbB2等。

3.2胞核型 陽性顆粒定位于細胞核，呈均勻分布或位于核膜下，有的呈小斑塊狀不規則分布。此多見于增殖細胞核抗原（PCNA、Ki-67）及激素受體中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和基因P53等。

3.3胞漿型 陽性顆粒主要分布于細胞漿。大部分抗原均屬于此種類型，如細胞角蛋白、波形蛋白、結蛋白、神經絲蛋白、肌紅蛋白及前列腺特異性抗原（PSA）等。

3.4微絨毛型 抗原顆粒主要分布于腺癌細胞的微絨毛，而胞漿和胞膜可以是陽性或陰性表達。這種表現形式最常見于各種腺癌，如甲狀腺腺癌、乳腺腺癌等。其特點是陽性顆粒除靠近腔面陽性外，其余基底部可呈陰性反應。在腫瘤標記物中多見于上皮膜抗原、結腸相關抗原等。甲狀腺腺癌中甲狀腺球蛋白常以該形式出現。

3.5復合型 在常規免疫組化標記中，同一種抗原可同時表達于胞膜和胞漿、胞核和胞漿、微絨毛和胞漿、但很少發現胞膜和胞核同時表達。以下情況可干擾免疫組化標記結果的觀察和判斷：①抗體交叉反應；②腫瘤細胞異常表達；③腫瘤細胞吞噬組織抗原。

4 免疫組化結果的判讀原則及對假陰性和假陽性的認識

免疫組化具有特異性強、敏感性高及定位正確等優點，因此，掌握對免疫組化結果的判讀原則是很重要的。

4.1必須設染色對照 每批染色都要以特異性的陽性對照和陰性對照為基礎，才能對染色結果做出正確的判讀。沒有陽性對照，就不能做出真正陰性結果的判斷；同理，沒有陰性對照，也就不能做出真正陽性結果的判斷。因而，沒有對照的免疫組化染色，即使做出了判斷也是不可信的。

4.2抗原表達必須在特定部位 陽性表達必須在細胞和組織特定的抗原部位才能視為陽性，如LCA在細胞膜上，不在抗原所在部位的陽性表達一概不能視為陽性。

4.3陰性結果不能視為抗原不表達 即陰性結果不能認為具有否定意義：陽性表達有強弱、多少之分，即使是只有少數細胞陽性（但要在抗原所在部位）也要視為陽性表達，不能認為個別細胞陽性而不作陽性看待。

4.4免疫組化與HE切片診斷應以HE切片診斷為準 當免疫組化診斷結果與HE切片診斷不一致時，應再結合臨床資料、影像學及實驗室結果綜合分析，不能用免疫組化檢查結果推翻HE切片診斷。

4.5假陰性結果的原因 ①抗體已失活或濃度不當或抗體本身達不到應有的敏感度；②由于組織自溶，抗原擴散而導致抗原消失，特別在長期固定的標本中因抗原漏出而導致假陰性，因此應多用新鮮固定的標本；③操作步驟不當，如反應時間不夠或過久、洗脫不夠或溫度過高；④組織或細胞中抗原的含量很低，所用的方法難以檢測到，如用直接法檢測為陰性，但改用間接法時則為陽性。

4.6假陽性結果的主要原因 ①所用的抗體與其它無關的抗原有交叉反應，特異性差，特別在應用多克隆抗血清時更易出現；②所用抗體濃度過高或染色過程中切片干燥導致抗體與組織產生非特異性結合；③組織或細胞中內源性過氧物酶、堿性磷酸酶及生物素等產生非特異性顯色操作中。

5 注意事項

免疫組化過程中應注意以下問題。

5.1均勻的背景染色 ①酶-底物反應時間過長；②在孵育中切片干燥；③一抗或二抗稀釋度不夠；④切片洗滌不充分；⑤封閉所用的正常血清不對二。

5.2部分區域背景著色 ①切片部分區域干燥；②顯色反應物在封片介質中是可溶的，造成彌散。

5.3部分區域不著色 ①脫蠟不完全；②切片部分區域干燥。

5.4各種孵育結果所有抗體均不著色 ①H2O2濃度不夠或存放過久失效；②稀釋液中有錯誤的正常血清（如豬抗兔酶標抗體稀釋液中有正常兔血清）；③顯色反應物溶于脫水的酒精、二甲苯或封片液中。

5.5某些抗體不著色 ①需要消化而沒有消化；②封閉內源酶時使抗體活性下降；③切片在裱片或干燥時過熱；④抗體過度稀釋，一抗濃度小于二抗；⑤抗體過期或頻繁凍融。

5.6內源性酶活性 H2O2-甲醇封閉不恰當。

5.7脫片 ①切片無粘附試劑；②切片不干凈；③冰凍切片：組織在貼片前已經充分固定。

5.8核輪廓模糊 ①切片已干燥（特別是冰凍切片）；②蘇木素染液欠佳。

5.9非特異性色淀 ①底物-顯色液使用前未經過濾；②抗體使用前未離心。

5.10陽性反應太弱 ①抗體或其它試劑活性下降；②顯色反應時間過短；②某些抗體的稀釋度或孵育時間不夠；④滴加抗體時切片上緩沖液過多。

5.11切片鏡下模糊或黑點沉著 ①脫水不徹底：進入二甲苯前加一步等量石炭酸/二甲苯混合液；②溫箱干燥替代脫水過程

編輯/周蕓霏