HDAC6在ISO誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化中的作用研究

摘要：目的 本實驗探討HDAC 6在ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化動物模型中表達機制。方法 將SD大鼠隨機分為兩組，每組各20只。設(shè)正常組和模型組。其中模型組的大鼠予以誘導(dǎo)劑ISO 1次/d[5mg/（kg·d）]皮下注射，另一組給予等劑量的生理鹽水，持續(xù)7d。取其血液和心肌標(biāo)本，測定其心臟質(zhì)量指數(shù)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測I型和III型膠原的含量；采用HE和Masson染色法觀察大鼠心肌纖維化程度；蛋白質(zhì)免疫印跡法測定HDAC 6和α-SMA蛋白的表達情況；采用qRT-PCR技術(shù)檢測HDAC 6的mRNA的表達情況。結(jié)果 模型組和正常對照組相比，心臟質(zhì)量指數(shù)明顯增加（P<0.05）；HE染色和Masson染色顯示模型組膠原纖維增生。I、III型膠原較對照組有相對明顯增加（P<0.05）；Western blot法示模型組蛋白表達顯著大于正常組（P<0.05），而且α-SMA的表達顯著大于正常組（P<0.01）；qRT-PCR檢測模型組中mRNA表達明顯大于正常組（P<0.05）。結(jié)論 HDAC6在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：心肌纖維化；HDAC6；α-SMA

Abstract：Objective The experiment was to investigate the expression of HDAC 6 in the rat model of myocardial fibrosis induced by ISO.Methods SD rats were randomly divided into 2 groups，each group of 20 which to set up the normal group and model group.The model group was treated with ISO daily by 5mg/kg for 7 d，the another group was given the same amount of saline.Take its blood and myocardial specimens.And tested its Heart quality index.ELISA was used to detected the content of type I and type III collagen.USed HE staining and Masson staining to observe the degree of myocardial fibrosis.The expression of HDAC6 andα-SMA were tested by Western blot.The mRNA expression ofα-SMA and HDAC6 were examined by qRT-PCR.Results Compared with model group，heart mass index was increased（P<0.05）；HE staining and Masson staining showed collagen fiber hyperplasia in model group；Collagen type I and III in model group have increased relatively（P<0.05）；Western blot showed that protein expression in model group was higher than normal group（P<0.05），α-SMA expression is obviously higher than normal control group（P<0.01）；QRT-PCR detection showed that mRNA expression in model group was higher than normal group（P<0.05）.Conclusion HDAC6 in plays an important role in development and incidence of myocardial fibrosis.

Key words：Myocardial fibrosis；HDAC6；α-SMA

心肌纖維化是由較大程度的冠脈硬化性狹窄導(dǎo)致的反復(fù)持續(xù)性心肌缺血加劇所的結(jié)果，從而逐步發(fā)展成為心肌慢性缺血性心臟病。本實驗研究的HDAC6作為II型HDAC家族的關(guān)鍵成員之一，在腫瘤的產(chǎn)生過程中起著有突出的作用，抑制相關(guān)活性的表達可以作為治療惡性腫瘤相當(dāng)重要的途徑，然而對于其是否影響心肌重構(gòu)中的重要步驟心肌纖維化罕有見聞。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1動物：SPF級SD♂大鼠，200±20g，[實驗動物使用許可證SCXK（皖）2011-002]。

1.1.2藥品與試劑：異丙腎上腺素由上海禾豐制藥有限公司提供；ELISA試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；HDAC6一抗美國Abcam公司提供；α-SMA、β-actin購自武漢博士德生物工程有限公司；二抗由中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，其余為分析劑。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型建立：隨機均分為兩組，設(shè)立模型組和正常組，每組各20只。①模型組：皮下注射ISO溶液（5mg/kg-1·d-1），1次/d，持續(xù)不間斷注射7 d；②正常組：皮下注射生理鹽水溶液（5mg/kg-1·d-1），其他過程同模型組。

1.2.2標(biāo)本采集及處理：正常組和實驗組在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下喂食1w后處死，處死大鼠，腹主動脈采血抗凝備用；剖開胸腔，減去大鼠心臟，稱全心重和左心室重量；之后迅速放入10%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)包埋，切片5張，厚4μm；運用HE、Masson染色方法檢測纖維化程度；殘存心臟標(biāo)本均放入凍存管，于液氮罐中保存。

1.2.3心臟質(zhì)量指數(shù)的測定：①末次給藥后只飲水24h，稱重；②腹腔麻醉后，剖胸取血，備用，取心臟；③洗凈、吸干后，稱全心重量，剝離左心室，稱重，計算心重指數(shù)和左心室重指數(shù)。

1.2.4 HE和Masson染色以及心肌CVF計算：將切片經(jīng)烤熱后于二甲苯和梯度乙醇溶液中脫蠟至水。更換溶液，再重復(fù)上述步驟；蘇木精染5min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇快速分化，流水稍洗，促藍液返藍數(shù)秒，流水沖洗；然后依次行HE染色和Masson染色。固定切片，光學(xué)顯微鏡下觀察、攝片。在每張Masson染色切片中，挑取出3個非血管視野（×400），使用圖像掃描軟件Image Proplus6.0進行掃描分析；計算CVF（%）：膠原面積/總視野面積×100%。

1.2.5 I型及III型膠原含量的檢測：血標(biāo)本取出后，提取血清；依照ELISA試劑盒操作指南進行：包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)、結(jié)果判定。分析并酶標(biāo)儀測定I型III型膠原的含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算膠原蛋白含量

1.2.6 HDAC6和α-SMA蛋白表達測定：①心肌總蛋白的提取：取出0.1g心肌組織塊，均漿機充分打散并研磨成均勻糊狀，置入離心管中；給予RIPA容液1毫升，放置冰上裂解30min、4℃離心機12000轉(zhuǎn)/min，40min；管中提其上清液，測蛋白濃度，變性后于-80℃冰柜中保存留用；②蛋白質(zhì)電泳：采用常規(guī)凝膠電泳系統(tǒng)；③免疫印跡雜交：200mA恒流電轉(zhuǎn)印1h。PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，一抗工作液，4℃搖床過夜。洗膜，二抗工作液，37℃孵育1h，洗膜；④顯影：將A和B發(fā)光液按等體積混合；滴于PVDF膜上，壓片，曝光，定影；⑤采用Lab Works 4.5圖像獲取和分析系統(tǒng)軟件測定蛋白條帶的積分光密度，以β-肌動蛋白作為參考的成像重復(fù)3次。

1.2.7 HDAC6、α-SMA mRNA表達：①RNA提取：用核酸提取劑測定心肌細(xì)胞中總核糖核酸，測定其核酸，以吸光值為計量，鑒定RNA的含量；②反轉(zhuǎn)錄：以總RNA為模板，嚴(yán)格按照試劑盒說明，合成cDNA；③PCR擴增：以β-肌動蛋白作為內(nèi)參照。依次由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟進行實時定量PCR擴增，引物序列如下（見表1）；④電泳及結(jié)果測定：制作瓊膠糖凝膠；取適量的PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，10V/cm電泳45～60min，成像系統(tǒng)成像分析，引物序列如下。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 以SPSS 16.0完善數(shù)據(jù)處理，采用（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVW/BW和HW/BW參數(shù)測定 實驗組與正常組相比，LVW/BW和HW/BW參數(shù)有所提升，差異有顯著性（P<0.05）。見表2。

2.2血清中I型、III型膠原的含量影響 模型組I型膠原和III型膠原的含量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明通過皮下注射異丙腎上腺素能夠引起大鼠血清中I型膠原和III型膠原的含量的增加。

2.3 HE染色和Masson染色以及心肌CVF計算 檢測結(jié)果顯示：模型組：間質(zhì)成分增多且排列不整齊，核間距離明顯增大，含纖維組織沉積；正常組：細(xì)胞形態(tài)大小基本大致相同且整齊，核間距大致相等，無纖維化表現(xiàn)，見圖1；心肌CVF計算，模型組CVF明顯高于正常組，見圖2。

圖1 模型組與正常組大鼠心肌HE染色及Masson染色×200

A：正常組；B：模型組；1：HE染色；2：Masson染色

圖2 模型組與正常組大鼠心肌CVF的比較

注：與正常組相比：*P<0.05

2.4 Western blotting法 與正常組相比，模型組大鼠心肌組織，HDAC 6含量和α-SMA含量相對升高，以此表明模型組中的HDAC6及α-SMA蛋白高表達（見圖3）。

圖3 HDAC 6和α-SMA蛋白表達變化

注：與正常組相比：*P<0.05，**P<0.01

2.5 qRT-PCR 選用相對定量法對大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的HDAC6基因相對于β-肌動蛋白基因的表達變化進行測定。模型組HDAC6和α-SMA mRNA含量較正常組有著較大的增加，模型組中的HDAC6和α-SMA轉(zhuǎn)錄水平要高于對照組（見圖4）。

圖4 HDAC 6和α-SMA mRNA表達變化

注：與正常組相比：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

心肌組織由心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞組成。心肌細(xì)胞最主要組成部分是成纖維細(xì)胞。當(dāng)心肌肥厚發(fā)生時，心肌細(xì)胞失去分裂的能力，僅表現(xiàn)為增生性生長，心肌成纖維細(xì)胞仍具備有絲分裂的能力，呈增生性生長。其在刺激因子作用下表達合成膠原蛋白的能力增加。心臟成纖維細(xì)胞能分泌多種活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)自己生產(chǎn)膠原蛋白和周圍的心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能。

心肌纖維化是細(xì)胞外的基質(zhì)不規(guī)則代謝而引起過多的膠原纖維沉積用來代替心臟的損傷，是各種心血管疾病進展到終末期的相同病理表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，α-SMA蛋白是心臟成纖維細(xì)胞活化中最重要的蛋白[1]。因此，我們決定將其作為一個重要的指標(biāo)來評估心肌纖維化的嚴(yán)重程度。該實驗動物模型的制備是通過ISO完成心肌纖維化。實驗結(jié)果表明測定的纖維化組I型、III型膠原的含量有所增加。同時，纖維蛋白染色法提示：模型組心肌組織間質(zhì)呈現(xiàn)纖維化改變。對比文獻造模數(shù)據(jù)表明，該實驗造模是成功的，該方法簡便易行，可重復(fù)。

心肌纖維化是心臟損傷代償?shù)慕Y(jié)果，是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理過程[2]。心肌間質(zhì)的主要組成細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，通常多處于未激活狀態(tài)。但其在決定纖維化細(xì)胞促進因子作用下被激活并大量增生，活化的成纖維細(xì)胞表達a-SMA并分化為肌成纖維細(xì)胞。故心肌成纖維細(xì)胞的基因調(diào)控是引起心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的最重要的步驟。心肌成纖維細(xì)胞類似成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，可以作用表達為α-SMA和收縮蛋白。不同于肌成纖維細(xì)胞的是，心肌成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外膠原的沉積的作用不是很明顯[3]。在心肌組織中，成纖維細(xì)胞的病理學(xué)改變致使心肌順應(yīng)性降低，心室舒張功能不全甚至誘發(fā)心衰[4]。而致纖維生長因子調(diào)控著膠原的轉(zhuǎn)錄與合成[5]。α-SMA是心肌成纖維細(xì)胞的活化的重要標(biāo)志物之一[6]。心肌成纖維細(xì)胞具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，是細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多的主要來源，最終導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，α-SMA是判斷心肌纖維化嚴(yán)重程度的代表性的指標(biāo)。

目前已有很多相關(guān)研究證實HDAC6與多種腫瘤方面有著較高表達，通過與α-SMA、泛素化等多種方式參與腫瘤的調(diào)控。HDAC6異常結(jié)合到特定的啟動子區(qū)從而抑制正常功能基因的轉(zhuǎn)錄可能是惡性腫瘤發(fā)生的機制之一。目前為止，癌癥的治療已有著突破性的進展，其中HDAC6抑制劑的應(yīng)用起到相當(dāng)重要的作用。多種HDAC6抑制劑治療腫瘤已進入臨床試驗階段。然而HDAC6在這種研究腫瘤的道路中如火如荼，卻在心肌纖維化中少有報道。在本文中通過構(gòu)造大鼠心肌纖維化模型，從而探究出HDAC6在心肌纖維化中是有某種相關(guān)性，進而研究HDAC 6在心肌纖維化中的作用。Western blotting法和qRT-PCR技術(shù)均提示：與正常組相比，造模組中的HDAC 6和α-SMA轉(zhuǎn)錄及翻譯水平都有明顯的上升。那心肌纖維化中HDAC6和α-SMA是如何調(diào)控的呢，α-SMA是否會直接影響心肌纖維化我們不從而知，這也是本實驗的不足之處。本實驗結(jié)果僅提示兩者之間是一種關(guān)聯(lián)現(xiàn)象，為之后心肌纖維化的深入研究提供基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Tao H，Shi K H，Yang J J，et al.Histone deacetylases in cardiac fibrosis：Current perspectives for therapy[J].Cell Signal，2014，26（3）：521-527.

[3]Zeng Q C，Guo Y，Liu L，et al.Cardiac fibroblast-derived extracellular matrix produced in vitro stimulates growth and metabolism of cultured ventricular cells[J].Int Heart J，2013；54（1）：40-44.

[4]Olmedo I，Munoz C，Guzman N，et al.EPAC expression and function in cardiac fibroblasts and myofibroblasts[J].Toxicol Appl Pharmacol，2013 ，272（2）：414-422.

[5]Engebretsen K V，Lunde I G，Strand M E，et al.Lumican is increased in experimental and clinical heart failure，and its production by cardiac fibroblasts is induced by mechanical and proinflammatory stimuli[J].FEBS J，2013，280（10）：2382-2398.

[6]Purnomo Y，Piccart Y，Coenen T，et al.Oxidative stress and transforming growth factor-β1-induced cardiac fibrosis[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2013，13（2）：165-172.

[7]Tao H，Shi K H，Yang J J，et al.Histone deacetylases in cardiac fibrosis：Current perspectives for therapy[J].Cell Signal，2014，26（3）：521-527.

編輯/金昊天