轉錄因子twist在食管癌中表達的意義

賀 波，鄭琇山，姜建青，俞永康，鄭軼峰，李 衛，楊 列，梁 瑜

轉錄因子twist在食管癌中表達的意義

賀 波，鄭琇山，姜建青，俞永康，鄭軼峰，李 衛，楊 列，梁 瑜

目的研究轉錄因子twist在食管鱗狀細胞癌（簡稱食管癌）中細胞亞定位及臨床意義。方法采用免疫組化染色方法檢測twist在58例食管癌及對應癌旁組織表達情況，并分析其細胞亞定位與患者性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、淋巴結轉移等臨床資料的關系。結果twist在食管癌細胞漿及細胞核中表達水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.01）；twist在細胞漿的表達水平與患者性別、年齡、位置、TNM分期及淋巴結轉移均無顯著相關性（P＞0.05）；twist在食管癌細胞核中的高表達與患者TNM分期及淋巴結轉移密切相關(P＜0.01)，而與患者性別、年齡及食管癌位置無顯著相關性（P＞0.05）。結論twist在食管癌細胞核中高表達，與腫瘤惡性進展密切相關，可能是食管癌惡性進展的重要標記物。

食管；鱗狀細胞癌；轉錄因子；twist；TNM分期；臨床意義

食管癌在全球腫瘤發病率占第8位，死亡率居第6位，盡管近年來在手術及放化療方面取得一定進展，但食管癌易發生轉移是導致患者死亡的重要原因[1]。由于缺乏有效的生物標記物及治療靶點，食管癌早期診斷主要依靠內鏡檢查。但大多數患者具有臨床癥狀后才能發現，一般已處于中晚期，其預后生存仍然較差。因此研究與尋找食管癌發生及轉移的生物標記物，對提高食管癌臨床診治水平至關重要。twist為一種調節表皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的重要轉錄因子[2]，在腫瘤惡性進展中發揮重要作用，是目前的明星分子，但其在食管癌中的生物學作用研究較少，本研究應用免疫組化染色方法研究其在食管癌中表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2012年6月～2014年5月在本科行食管癌切除患者58例，其中男性37例，女性21例，年齡38～72（52.3±10.6）歲。均因進食梗阻、胸骨后不適、燒心、黑便等原因行電子胃鏡檢查發現食管占位性病變，并經組織活檢確定為食管鱗狀細胞癌；術前均未接受針對腫瘤的任何治療。手術切除標本經福爾馬林固定、石蠟包埋后存放于我院病理科。

1.2 免疫組化染色 將上述患者的食管癌及癌旁組織蠟塊切片烘干后，將切片浸泡于100%二甲苯中30 min，后更換另一組100%二甲苯中浸泡30 min；然后將切片依次置于100%、90%、80%及70%乙醇中分別浸泡8 min，PBS沖洗3次，每次5 min；切片置于煮沸的pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中3 min進行抗原修復后，滴加正常山羊血清進行抗原封閉30 min，3%H2O2中放置20 min去除過氧化酶活性，再次PBS清洗3次。滴加PBS配制的小鼠抗twist單克隆抗體 (1∶500,Abcam)，于4℃冰箱過夜。用PBS充分清洗切片3次，每次5 min，滴加兔抗鼠二抗（1∶2000，北京中杉公司），室溫下靜置40 min后，再次PBS充分清洗，DAB顯色液顯色，大約30 s后顯色清楚后清水清洗。蘇木精復染3 min后，清水沖洗3 min,蒸餾水漂洗2 min后，再將切片滴加樹脂并用蓋玻片封片。

1.3 免疫組化結果判定 免疫組化結果由我院資深病理師在Olympus顯微鏡下進行，以細胞漿或細胞核呈黃色或棕黃色為陽性信號，先在低倍鏡(50×)下大體觀察表達情況，然后取100倍視野下進行計數與拍照。按細胞著色程度評分：0分（無著色）；1分（淺黃色）；2分（棕黃色）；3分（棕褐色）；按色細胞比例評分：0分（無陽性細胞）；1分（陽性細胞比例1%～25%）；2分（26%～50%）；3分（51%～75%）及4分（76%～100%）。兩項的積分之和＜3分記為陰性（-），3～7分為陽性（+）。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，組間陽性表達率比較采用χ2檢驗，twist表達水平與患者臨床參數關系采用Kruskal-Wallis U檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 twist在食管癌及癌旁組織細胞亞定位情況免疫組化染色結果顯示，twist可在細胞核及細胞漿呈陽性表達，其在食管癌組織細胞漿陽性及陰性表達率分別為34.5%（20/58）、65.5%（38/58）；在食管癌細胞核陽性與陰性表達率分別為 72.4%（42/58）、27.6%（16/58）。twist在癌旁組織中細胞漿陽性及陰性表達率分別為17.2%（10/58）、82.8%（48/58）；在癌旁組織細胞核陽性與陰性表達率分別為13.8%（8/58）、86.2%（50/58）。統計學分析提示，twist在食管癌細胞漿與細胞核中陽性表達率均顯著高于癌旁組織(P＜0.05，圖1）。

圖1 免疫組化染色tw ist在食管癌及癌旁組織中表達

2.2 twist在食管癌細胞亞定位與臨床資料的相關性 入選患者食管癌位于食管上、中、下分別為6、 32、20例；TNM分期中Ⅰ+Ⅱ與Ⅲ+Ⅳ期分別為27、31例；淋巴結轉移N0+N138例，N2及以上患者20例。進一步分析twist在食管癌細胞亞定位與患者臨床參數的相關性發現，twist在細胞漿中表達水平與患者年齡、性別、腫瘤位置、TNM分期及淋巴結轉移均無顯著相關性（P＞0.05），提示其在食管癌細胞漿中的表達與腫瘤惡性進展程度無相關性；twist在食管癌細胞核中的表達水平與患者性別、年齡及食管位置無顯著相關性（P＞0.05），但其高表達與更晚的患者TNM分期及淋巴結轉移顯著相關 （P＜0.05，表1），提示twist在細胞核中的高表達與食管癌惡性進展密切相關。

3 討論

食管癌是世界高發的惡性腫瘤，尤其是四川地區近年來發病率逐年上升，已被國家列為十大特色腫瘤之一[3]。據報道，中晚期食管癌5年的生存率非常低，大多數研究報道均不超過10%，而早期食管癌可以通過內鏡下、胸腔鏡或開胸手術切除，患者可獲得很好的預后、甚至治愈。但是由于我國人口眾多，加上胃鏡檢查對患者帶來痛苦，因此，無法將電子胃鏡檢查作為常規體檢項目，而大多數早期食管癌患者無任何癥狀，當出現進食梗阻、胸骨后不適時，大多數處于中晚期，使食管癌早期診斷患者較少，在本研究患者中TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期患者只有46.5%（27/58），而Ⅲ+Ⅳ期患者達53.4%（31/58）；手術切除樣本中，只有15例未發現淋巴結轉移，其余43例均發現淋巴結轉移，提示早期診斷患者比例較小，是造成預后差的重要原因。另外，目前針對食管癌早期診斷、生物靶向治療的標記物報道較少，且由于腫瘤的異質性使單一分子標記物無法滿足臨床診斷與治療需要，因此，尋求高效的食管癌標記物意義重大。

表1 twist在食菅鱗狀細胞癌中亞定位與臨床參數的相關性（例）

本研究結果顯示，twist在食管癌細胞漿及核中陽性表達率均顯著高于對應的癌旁組織，進一步分析發現，twist在細胞漿中表達水平與患者性別、年齡、TNM分期及淋巴結轉移等臨床參數均無相關性，提示twist在細胞漿中的表達水平與食管癌惡性進展無相關，其具體的的生物學功能尚需進一步深入研究。但分析twist在食管癌細胞核中表達的意義發現，其表達水平與患者性別、年齡、食管位置無顯著相關性，而其高表達與患者較晚的TNM分期及淋巴結轉移密切相關，提示twist的表達水平與食管癌發生、發展、侵襲及轉移等惡性生物學行為相關，可能在食管癌惡性進展中發揮重要作用，也可能是一種重要的分子標記物。也進一步說明twist作為一種重要的轉錄因子，其在腫瘤惡性進展中發揮生物學功能的地點位于細胞核。

在胃癌中，twist可通過調控Siah2來促進HP感染相關胃癌細胞的惡性增殖[4]；另一項研究表達，在胃癌中PAQR3可促進twist的降解來抑制EMT發生，從而抑制胃癌細胞侵襲、遷移及轉移能力[5]。對其上游調控分子研究發現，在結腸癌細胞中，非編碼小RNA miR-381可通過抑制twist的轉錄水平發揮抑制腫瘤細胞惡性生長的作用[6]。在非小細胞肺癌的研究中發現，miR-32可通過靶向抑制twist來抑制腫瘤細胞增殖、EMT及轉移[7]。在肝癌研究中發現，miR-26b-5p是其上游調控的又一重要分子[8]。本研究結果提示twist在食管癌發生、發展中可能起重要作用，但是否通過調節食管鱗狀細胞癌EMT來發揮作用？其上游調控分子機理又是什么？有待于將來的研究中深入探討。

總之，本研究通過免疫組化方法研究發現，twist的核定位在食管癌發生、發展及轉移等惡性生物學行為中起重要作用，可能是食管癌重要的生物標記物，為進一步研究食管癌發生及轉移機制提供了線索。

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[3] 赫捷,邵康.中國食管癌流行病學現狀、診療現狀及未來對策[J].中國癌癥雜志,2011,21(7):501-504．

[4] Das L,Kokate SB,Rath S,et al.ETS2 and Twist1 promote invasiveness of helicobacter pylori-infected gastric cancer cells by inducing Siah2[J].Biochem J,2016,473(11):1629-1640.

[5] Guo W,You X,Xu D,et al.PAQR3 enhances twist1 degradation to suppress epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer cells[J].Carcinogenesis,2016,37(4):397-407.

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[8] Wang Y,Sun B,Zhao X,et al.Twist1-related miR-26b-5p suppresses epithelial-mesenchymal transition,migration and invasion by targeting SMAD1 in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget,2016,doi:10.18632/oncotarget.8328.

Significance of expression of transcription factor twist in esophageal squamous cell carcinoma

He Bo,Zheng Xiushan,Jiang Jianqing,Yu Yongkang,Zheng Yifeng,Li Wei,Yang Lie,Liang Yu Department of Thoracic Surgery，General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan，610083,China

Objective To study the clinical significance of the expression of transcription factor twist in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).MethodsThe immunohistochemical staining was used to detect the expression of twist in 58 pairs of ESCC and matched non-cancerous tissues,and the relationship between twist expression in ESCC cytoplasm and nuclear with patient age, gender,tumor location,TNM stage and lymph node metastasis was analysized.ResultsBoth the expression of twist in ESCC cytoplasm and nuclear were significantly higher than that in matched non-cancerous tissues(P＜0.01).The expression of twist in ESCC cytoplasm was not statistically correlated with patients'clinical parameters(P＞0.05);the expression of twist in ESCC nuclear was significantly correlated with advantaged TNM stage and lymph node metastasis,but not with age,gender or tumor location(P＞0.05).ConclusionThe highly expression of twist in ESCC nuclear is correlated with the malignant progression of tumor,indicating that twist expression in nuclear is a critical markers of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma;twist；expression;cell nuclear

R 735.1

A

1004-0188（2016）12-1419-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.019

2016-06-16）

成都軍區總醫院研究型人才資助項目（2013YG_B027）

610083，成都，成都軍區總醫院胸外科

鄭琇山，Email:xiushanzheng@126.com