臍帶間充質干細胞對膠質瘤細胞轉移侵襲能力影響初探

劉高米洋，朱 慧，何 潔，劉菊芬，阮光萍，李自安，潘興華

臍帶間充質干細胞對膠質瘤細胞轉移侵襲能力影響初探

劉高米洋，朱 慧，何 潔，劉菊芬，阮光萍，李自安，潘興華

目的觀察人源臍帶間充質干細胞（HUCMSC）對膠質瘤細胞株U87轉移、侵襲能力的影響。方法建立細胞共培養體系，CCK8法、transwell法和Matrigel法分別檢測 HUCMSC與U87非接觸共培養后，U87增殖、轉移、侵襲能力變化。結果體外細胞共培養體系中，HUCMSC共培養U87組（實驗組）比U87單獨培養組（對照組）轉移和侵襲能力都有顯著提高（P＜0.05），HUCMSC共培養對U87有促增殖作用。結論在體外共培養體系中，HUCMSC可能通過促進EMT轉化而提高膠質瘤細胞株U87增殖、轉移和侵襲潛能。因此，在HUCMSC的臨床轉化應用中，應該考慮其可能的促腫瘤作用。

臍帶；間充質干細胞；膠質瘤；轉移；侵襲

由于臍帶間充質干細胞的免疫原性較低、易取材、容易擴增等優點，被認為是一種潛在的組織修復、抗衰老的新型生物治療手段。近年研究發現，間充質干細胞能夠定向遷移到某些特定的腫瘤部位，一部分研究顯示，間充質干細胞能夠促進腫瘤的發生發展，但也有學者報道，遷移到腫瘤部位的間充質干細胞有抑制腫瘤生長的作用。本實驗以惡性程度較高的膠質瘤細胞株U87為研究對象，旨在研究臍帶間充質干細胞對U87細胞的生物學行為的影響及其可能機制，為臍帶干細胞的臨床轉化應用提供資料，進一步明確臍帶干細胞應用的安全性和適用性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材 DMEM/F12培養基 （美國Hyclone公司），胎牛血清（美國BI公司），雙抗（美國BI公司），Trizol（美國Invitrigen公司），GoTag qPCR Master Mix（美國Promega公司），Anti-Ki67 antibody、Anti-E-cadherin antibody、Anti-N-cadherin antibody、anti-GAPDH antibody（美國abcam公司），兔抗鼠IgG H&L（HRP），羊抗兔IgG H&L（HRP），qPCR引物由Thermo公司設計合成；百萬層級層流超凈工作臺（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司），細胞培養37℃、CO2孵箱（美國Thermo公司），電泳槽（Bio-rad公司），Matrigel Invasion Chamber（BD公司），Transwell Chamber（美國Costar公司）。

1.2 細胞株和實驗動物 U87細胞株購于中科院昆明動物所，人源臍帶間充質干細胞（HUCMSC）來自本實驗室分離培養的剖腹產臍帶3～5代間充質干細胞。

1.3 人臍帶間充質干細胞分離和培養 在產婦及其家屬知情同意下，取本院足月剖腹產新生兒臍帶，經檢測產婦無傳染性疾病，胎兒無先天性疾病和畸形。無菌條件下，將采集的臍帶用生理鹽水反復沖洗，去掉殘留血液。將臍帶剪碎后轉移到培養瓶中，用含20%FBS的DMEM/F12培養基培養，次日補液，3 d后換液，7 d后觀察細胞生長狀態，達到80%融合后傳代培養。

1.4 增殖能力檢測 消化對數生長期U87細胞，計數后將細胞懸液貼壁輕柔加入96孔板中，實驗組采用50%MSC培養上清加50%DMEM/F12完全培養基，對照組采用DMEM/F12完全培養基。6 h后為檢測起始點，此后每隔24 h檢測1次。CCK8法記錄細胞生長曲線。

1.5 轉移侵襲能力檢測 Transwell實驗：消化第5代對數生長期HUCMSC，在24孔板中分別種入0、1.0×104、2.0×104、3.0×104個 HUCMSC；12 h后在8 μm Transwell Chamber中種入無血清培養的1.5× 104個U87細胞，將小室輕輕放入已種入HUCMSC的24孔板中。24 h后取出小室風干片刻，4%甲醛固定30 min，去除甲醛，結晶紫染色30 min。拍照計數細胞。

Matrigel實驗：消化第5代對數生長期HUCMSC，計數細胞密度，在24孔板中分別種入0、1.0×104、2.0× 104、3.0×104個 HUCMSC，無血清培養；12 h后在8 μm Matrigel Chamber中種入無血清培養的1.5× 104個U87細胞，將小室輕輕放入已種入HUCMSC的24孔板中。24 h后4%甲醛固定30 min，去除甲醛，結晶紫染色30 min。拍照計數細胞。

1.6 統計學方法 應用Graphpad統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HUCMSC的分離培養 將新鮮臍帶剪碎后，采用無酶直接貼壁法將組織塊直接放入培養瓶中，采用20%FBS的DMEM/F12培養基培養，待長滿傳代后，換用10%FBS的DMEM/F12培養基培養，大約次日即可看見少許細胞貼壁（圖1a），約3 d后可見細胞爬出（圖1b），傳代后的細胞轉移時呈纖維樣（圖1c），稠密呈漩渦狀生長（圖1d）。

圖1 臍帶間充質干細胞的生長形態

2.2 HUCMSC培養上清對U87增值能力的影響CCK8法檢測各組細胞增殖能力，結果提示，實驗組較對照組有更強的增殖能力（P＜0.05，圖2）。

圖2 CCK8實驗檢測HUCMSC對U87細胞增殖能力的影響

2.3 非接觸共培養HUCMSC對U87轉移侵襲能力的影響 穿梭實驗檢測U87在HUCMSC非接觸共培養條件下顯示，隨共培養HUCMSC數目增加，U87轉移能力遞增（圖3）。顯微鏡下計數穿過小室的細胞進行統計學分析，結果顯示有顯著差異（P＜0.05）。侵襲實驗檢測U87在HUCMSC非接觸式共培養條件下其侵襲能力的變化，見圖4，共培養組較對照組顯示出較強的侵襲能力（P＜0.05）。

圖3 Transwell實驗檢測非接觸共培養下MSC對U87細胞轉移能力的影響

圖4 Matrigels實驗檢測非接觸共培養下MSC對U87細胞侵襲能力的影響

3 討論

間充質干細胞具有免疫調控、造血支持、連續傳代和凍存后仍有自我修復和多向分化潛能等特點，在特定條件下，可分化為多種組織細胞，可作為種子細胞用于組織器官損傷修復和抗衰老[1]。HUCMSCs較其他來源間充質干細胞有增殖能力強、取材方便的優勢，因此，其臨床轉化應用前景廣泛，但安全性是間充質干細胞臨床轉化應用前必須明確的重要問題。近年研究發現，間充質干細胞能特異的向腫瘤部位遷移；部分研究顯示，遷移到腫瘤部位的間充質干細胞能促進腫瘤的生長[2]；而另一部分研究顯示，遷移到腫瘤部位的間充質干細胞能抑制腫瘤的生長[3-5]。

膠質瘤是一種最為常見的原發性腦腫瘤，同時也是一個全球性重大疾病問題，在美國每年有超過12 000人罹患膠質瘤[6]。惡性膠質瘤患者預后較差，半數生存時間為15個月[7]，手術和放化療治療效果都不理想，患者復發率極高。有文獻報道，間充質干細胞能夠向腫瘤部位遷移，這為腫瘤治療提供了一種理想的藥物載體[8]。本課題擬選用臨床上最常見的腦部腫瘤膠質瘤為切入點，選擇膠質瘤細胞系U87為研究對象，試圖探究臍帶間充質干細胞對膠質瘤細胞U87的增殖、轉移和侵襲能力的影響。

本研究采用CCK8法檢測了HUCMSC培養上清對U87的增殖能力的影響，結果提示，HUCMSC培養上清能夠促進U87增殖；非接觸式培養，提示HUCMSC可能促進U87細胞的增殖。這些結果提示，HUCMSC對腫瘤細胞增殖能力的影響不可一概而論，需要進一步明確其促增殖的作用機制。

EMT轉化是腫瘤發生轉移的重要理論之一，目前研究表明，腫瘤轉移復發不一定需要發生EMT轉化，但發生EMT轉化的腫瘤細胞轉移侵襲能力更強[9]。本研究中Transwell和Matrigel實驗結果提示，非接觸培養條件下，HUCMSC能夠明顯促進U87細胞的轉移和侵襲能力，并且隨著共培養的HUCMSC數量越多，其促轉移侵襲作用越明顯，提示HUCMSC可能通過分泌某些成分促進U87細胞的轉移和侵襲能力。還有研究發現，間充質干細胞能夠分泌一種直徑為20～100 nm的分泌小泡，又稱外泌體 （exosome），外泌體中包含miRNA、lncRNA和多種細胞生長因子[10]。間充質干細胞可能通過分泌外泌體釋放相關蛋白，促進U87的轉移侵襲能力，但需要進一步驗證。

綜上所述，HUCMSC作為一種潛在腫瘤藥物載體，其與腫瘤尤其是難治性腫瘤的相互影響是其臨床前應用的需要解決的基本問題。本研究結果表明，HUCMSC在非接觸式培養方式下，能促進U87細胞增殖、轉移和侵襲能力，但具體機制不甚明確，需進一步探求。

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[2] Karnoub AE,Dash AB,Vo AP,et al.Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J]. Nature，2007,449:557-563.

[3] Khakoo AY,Pati S,Anderson SA,et al.Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma[J].J Exp Med,2006,203:1235-1247.

[4] Qiao L,Xu Z,Zhao T,et al.Suppression of tumorigenesis by human mesenchymal stem cells in a hepatoma model[J].Cell Res, 2008,18:500-507.

[5] Zhu Y,Sun Z,Han Q，et al.Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1[J].Leukemia, 2009,23:925-933.

[6] Kleihues P,Cavenee WK.Pathology and genetics of tumours of the nervous system[J].Lyon:International Agency for Research on Cancer,2000,84(1):148.

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[8] Karnoub AE,Dash AB,Vo AP,et al.Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J].Nature, 2007,449(7162):557-563.

[9] Zhao Peng,Chen-Xiao Wang,Er-Hu Fang,et al.Role of epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer initiation and progression[J].World J Gastroenterology,2014,20(18):5403-5410. [10] Tang MK,Wong AS.Exosomes:emerging biomarkers and targets for ovarian cancer[J].Cancer Lett,2015,367(1):26-33.

Preliminary study on impacts of UC-MSCs on metastasis and invasion of GCs

Liugao Miyang,Zhu Hui,He Jie,Liu Jufen,Ruan Guangping,Li Zi'an,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming, Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the impacts of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUC-MSCs)on the metastasis and invasion of glioma cell(GC)line U87.MethodsA cell co-culture system was established.The changes in the proliferation, metastasis and invasion of U87 after the non-contact co-culture with HUC-MSCs were detected by CCK8 method,transwell method and Matrigel method.ResultsThe metastasis and invasion of U87 co-cultured with HUC-MSCs(in the experiment group)were much better than those of U87 separately cultured (the control group).ConclusionIn the co-culture system in vitro,HUC-MSCs may improve the proliferation,metastasis and invasion of glioma cell line U87 by promoting EMT transformation.Therefore,the potential tumor promoting effects of HUC-MSCs should be considered in the clinical transformation application.

HUC;MSC;glioma;metastasis;invasion

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1398-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.013

2016-06-28）

國家科技支撐計劃項目（2014BI01B0）；國家973計劃項目（2012CB5181060）；云南省科技計劃重點項目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室,云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，昆明市干細胞與再生醫學研究重點實驗室

潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com