C肽對高糖下腎足細胞凋亡和腎病蛋白的影響

游志清，郎紅梅，程 瑩，劉君靜，任 麗，萬 勇，郭 蔚，李寧娜，艾智華

C肽對高糖下腎足細胞凋亡和腎病蛋白的影響

游志清，郎紅梅，程 瑩，劉君靜，任 麗，萬 勇，郭 蔚，李寧娜，艾智華

目的探討C肽對高糖下腎足細胞凋亡和腎病蛋白的影響。方法將腎足細胞分成4組：對照組（5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖，下同）、C肽組（高糖+C肽）、百日咳毒素（PTX）組（高糖+C肽+PTX），干預24 h后，Western blot檢測磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和mTOR蛋白，免疫熒光法檢測腎病蛋白，TUNEL一步法檢測足細胞凋亡。結果5 nmol/L C肽即能顯著抑制高糖下足細胞mTOR的表達（P＜0.01）。與對照組相比，高糖組PI3K、Akt和 mTOR表達顯著升高（P＜0.05），腎病蛋白表達顯著下降（P＜0.01），足細胞凋亡顯著增加（P＜0.01）；與高糖組相比，C肽能逆轉高糖所致的上述變化 （P＜0.01），而PTX能消除或減弱C肽的上述逆轉作用 （P＜0.05）。結論C肽可抑制高糖激活的足細胞PI3K-Akt-mTOR信號通路，并減少高糖所致的足細胞腎病蛋白減少和足細胞凋亡。

C肽；足細胞；雷帕霉素靶蛋白；腎病蛋白；凋亡

足細胞在腎小球濾過屏障和結構完整性方面起到非常重要的作用，其受損是糖尿病腎病發生的重要啟動因素[1]。足細胞內mTOR活性的異常，可能是糖尿病腎病發生的關鍵因素[1-2]。在高糖刺激下，足細胞mTOR的活性明顯升高，導致腎小球肥大和基質合成增加，后者又導致基底膜和系膜增厚[3]。在1型糖尿病患者及大鼠的腎小球足細胞內，mTOR的活性明顯升高，并與尿白蛋白排泄呈明顯正相關[4]。PI3K-Akt-mTOR信號通路是經典的調節mTOR活性的通路。越來越多的證據表明，C肽是具有生物學功能的肽，可調節細胞內多種信號通路，生理濃度范圍C肽能減輕1型糖尿病患者腎小球的高濾過狀態，減少尿白蛋白排泄[5-6]，但其機制尚未明了。因此，本研究旨在探討C肽是否對足細胞內 PI3K-Akt-mTOR信號通路有調控作用及其對足細胞腎病蛋白和凋亡的影響，以進一步闡明C肽的腎保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑 小鼠腎足細胞（含tsSV40T序列）（江陰康眾康民生物醫藥技術有限公司，中國無錫）；胎牛血清（Hyclone，美國)；青-鏈霉素雙抗(GIBCO，美國)；DMEM培養基(GIBCO，美國)；胰蛋白酶(Trypsin)(上海生工生物工程有限公司)；PI3K，Akt，mTOR多克隆抗體（santaz cruz，美國），兔抗nephrin多克隆抗體（博奧森，bs-10233），Alexa Flour 488標記山羊抗兔抗體 （碧云天，A0423）；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）（碧云天）。人C肽（上海南方模式生物科技發展有限公司）；百日咳毒素（EBZO，美國）；葡萄糖（上海生物工程有限公司）。

1.1.2 儀器 二氧化碳培養箱 (TC2323型，SHELDON，美國)；倒置相差顯微鏡(XDS-1型，重慶光學儀器廠)；電子天平 (Shangping JA 21002，上海天平儀器廠)；凝膠掃描成像系統(Bio-Rad，美國)；TE2000-U倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將小鼠腎足細胞用DMEM低糖培養基(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗)于37℃，5%CO2條件下培養。當培養瓶中細胞融合至80%左右時開始傳代，經3～5次傳代，將細胞以5000個/cm2的密度接種至玻片上，給予無血清培養基饑餓24 h行干預實驗。

1.2.2 梯度實驗 將足細胞分為5組，分別是對照組(Cont組)（5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖，下同）(HG組)、高糖+1 nmol/L C肽組(1 nMC肽組)、高糖+5 nmol/L C肽組(5 nMC肽組)和高糖+ 10 nmol/L C肽組(10 nMC肽組)。干預24 h后，提取細胞總蛋白用于Western blot實驗檢測mTOR，確定C肽的最適干預濃度為5 nmol/L（表1）。

1.2.3 干預實驗 將足細胞分為分為4組，Cont組（同上）、HG組（同上）、高糖+5 nmol/L C肽組(C肽組)和高糖+5 nmol/L C肽+100 ng/ml PTX組(PTX組)，干預時間均為24 h。干預結束后，提取細胞總蛋白，Western blot檢測PI3K、Akt和mTOR蛋白水平，具體檢測方法參照各試劑盒說明書，凝膠成像系統掃描分析條帶光密度值(OD值)，計算各蛋白條帶光密度值與內參照GAPDH光密度值的比值。免疫熒光法檢測足細胞上nepherin蛋白，按試劑盒說明書操作，在TE2000-U倒置熒光顯微鏡下觀察，用NISElements成像軟件照相和蛋白定量分析，以對照組的熒光值為1，計算其他組的熒光值與其的比值作為其蛋白定量值。

1.2.4 足細胞凋亡檢測 采用一步法TUNEL檢測細胞凋亡，足細胞在玻片上生長融合至70%～80%時，從培養箱中取出。倒去培養液，PBS洗滌1次。免疫染色固定液（碧云天）固定30 min。PBS洗滌一次。加入含有0.1%Trinton X-100的PBS，冰浴孵育2 min。配置TUNEL檢測液，充分混勻。PBS洗滌2次，在樣品上加50 μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，每次5 min。用抗熒光淬滅封片液后，熒光顯微鏡下觀察計數凋亡細胞。

1.3 統計學方法 應用GraphPad.Prism.v5.0統計軟件進行分析，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同條件下mTOR表達 5 nmol/L的C肽對高糖誘導的足細胞mTOR表達的抑制作用最強（P＜0.01）。見表1。

表1 不同條件下mTOR的表達

2.2 不同條件下足細胞PI3K、Akt和mTOR腎病蛋白表達和凋亡 高糖可誘導足細胞PI3K、Akt和mTOR蛋白高表達，腎病蛋白表達下降，足細胞凋亡增加；C肽能逆轉高糖所致的上述變化 （P＜0.01），而PTX能消除或減弱C肽的上述逆轉作用 （P＜0.05）。見表2、圖1、2。

圖1 不同條件下足細胞PI3K、Akt和m TOR蛋白的表達

表2 不同條件下足細胞pI3K、Akt、mTOR、腎病蛋白表達和凋亡情況

圖2 不同條見下足細胞腎病蛋白表達和足細胞凋亡（白色箭頭指示）情況

3 討論

本研究發現，5 nmol/L的C肽（生理濃度范圍內）能抑制高糖誘導的腎足細胞mTOR表達增加，而再提高C肽濃度并不能增加這種抑制能力。PI3K、Akt處于PI3K-Akt-mTOR信號通路的上游，是調節mTOR表達的重要路徑[7]。本研究結果顯示，高糖下，足細胞PI3K、Akt表達也增加，提示高糖是通過激活PI3K-Akt途徑，調節mTOR表達增加。還發現C肽也能抑制高糖環境下足細胞PI3K、Akt的高表達。文獻報道，PTX能阻斷C肽逆轉高糖下腎小管上皮細胞纖維化的作用[8]。因此，PTX被認為是C肽的阻斷劑。本研究也觀察到，C肽抑制高糖誘導的腎足細胞PI3K-Akt-mTOR高表達作用被PTX阻斷。因此，在高糖環境下，生理濃度C肽對PI3K-AktmTOR信號通路可能有抑制作用。

Inoki等[1]通過特異性敲除鼠足細胞mTOR復合體1基因上游的抑制性調節子后，鼠足細胞內mTOR復合體1活性明顯升高，并復制出了糖尿病腎病的特征：足細胞丟失，腎小球基底膜增厚，系膜基質增加和蛋白尿形成。提示足細胞mTOR復合體1活性升高與糖尿病腎病的發生密切相關。足細胞膜上的腎病蛋白是腎小球基底膜中裂孔膜的重要組成，主要分布在細胞膜表面，起作阻止蛋白濾過的作用。本實驗發現，在高糖下腎病蛋白表達顯著下降，提示高糖下腎小球基底膜上裂孔膜屏障受損。生理濃度C肽能逆轉高糖對腎病蛋白的這種作用。同樣地，C肽的這種作用也被PTX阻斷，鼠足細胞內mTOR復合體1被激活引起腎病蛋白表達顯著減少并移位[1]。因此，C肽逆轉高糖環境對足細胞腎病蛋白表達的影響，可能與C肽抑制高糖誘導mTOR高表達有關。

同時，25 mmol/L葡萄糖刺激下，足細胞凋亡較5 mmol/L生理濃度葡萄糖刺激下明顯升高，而5 nmol/L的生理濃度C肽能顯著減少高糖刺激下的足細胞凋亡。同樣地，C肽逆轉高糖誘導的腎足細胞凋亡的這種作用也被PTX阻斷。Eid等[8]報道，高糖通過增加mTOR活性，促進腎足細胞凋亡，推測C肽可能通過抑制高糖激活的PI3K-Akt-mTOR通路，減少足細胞凋亡。

綜上所述，高糖環境下，腎小球足細胞PI3K-Akt-mTOR通路被激活，導致足細胞膜上的腎病蛋白表達下降，使腎小球基底膜中裂孔膜濾過屏障受損；同時，促進腎足細胞凋亡，二者可能是引起蛋白尿的重要原因。但生理濃度的C肽能逆轉高糖的前述作用。因此，C肽在防治1型糖尿病腎病中可能具有重要作用。鑒于Akt及mTOR對于足細胞功能及存活影響的復雜性，還需進一步研究，如觀察Akt或mTOR的磷酸化情況。

[1] Inoki K,Mori H,Wang J,et al.mTORC1 activation in podocytes is a critical step in the development of diabetic nephropathy in mice[J].J Clin Invest,2011,121(6):2181-2196.

[2] G?de M,Hartleben B,Herbachet N,et al.Role of mTOR in podocyte function and diabetic nephropathy in humans and mice [J].J Clin Invest,2011,121(6):2197-2209.

[3] Lieberthal W,Levine JS.The role of the mammalian target of rapamycin(mTOR)in renal disease[J].J Am Soc Nephrol,2009, 20:2493-2502.

[4] Siroky1 BJ,Bitzer M.The growing importance of mTORC1-S6K1 signaling in kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,297(3): F583-584.

[5] Hills CE,Brunskill NJ,Squires PE,et al.C-Peptide as a therapeutic tool in diabetic nephropathy[J].Am J Nephrol,2010, 31(5):389-397.

[6] Hills CE,Al-Rasheed N,Al-Rasheed N,et al.C-peptide reverses TGF-beta1-induced changes in renal proximal tubular cells: implications for treatment of diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,296(3):F614-621.

[7] Lu MK,Gong XG,Guan KL.mTOR in podocyte function:is rapamycin good for diabetic nephropathy[J]?Cell Cycle,2011,10 (20):3415-3416.

[8] Eid AA,Ford BM,Bhandary B,et al.Mammalian target of rapamycin regulates Nox4-mediated podocyte depletion in diabetic renal injury[J].Diabetes,2013,62(8):2935-2947.

Effects of C peptide on nephrin and apotosis in podocyte under high glucose

You Zhiqing,Lang Hongmei,Cheng Ying,Liu Junjing,Ren Li,Wan Yong,Guo Wei,Li Ningna,Ai Zhihua Department of Endocrinology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To explore the effects of C peptide on nephrin and apotosis in podocyte under high glucose.Methods Podocytes were divided into four groups:the control group (5 mmol/L glucose),the high glucose group (25 mmol/L glucose),the C peptide group(HG+C peptide),and the pertussis toxin(PTX)group(HG+C peptide+PTX).24 hours after the intervention,the levels of phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K),protein kinase B(Akt)and mTOR protein were detected by use of Western blotting method.The levels of nephropathy protein were detected by immunofluorescence.Podocyte apoptosis was detected by one-step method of TUNEL.Results5 nmol/L C peptide could significantly inhibit the expression of podocyte mTOR (P＜0.01).Compared with the control group,the levels of PI3K,Akt and mTOR in the high glucose group increased greatly (P＜0.05),the levels of nephropathy protein decreased significantly(P＜0.01),and podocyte apoptosis obviously increased (P＜0.01);compared with the high glucose group,C peptide could reverse the above changes caused by high glucose(P＜0.01),while PTX could eliminate or weaken the above reverse effect of C peptide(P＜0.05).ConclusionC peptide can inhibit the podocyte PI3K-Akt-mTOR signal channel activated by high glucose and lower the reduction of podocyte nephropathy protein and podocyte apoptosis.

Cpeptide;podocyte;mTOR;nephropathy protein;apotosis

R 692

A

1004-0188（2016）12-1413-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.017

2015-10-29）

四川省衛生廳科研課題（120567）

610083成都 成都軍區總醫院內分泌科