Notch1基因沉默抑制骨髓源性脂肪祖細胞向成熟脂肪細胞分化

王金祥，王小華，白盈盈，周 芳，蔡學敏，劉菊芬，李自安，余爭平，朱光旭，潘興華

Notch1基因沉默抑制骨髓源性脂肪祖細胞向成熟脂肪細胞分化

王金祥，王小華，白盈盈，周 芳，蔡學敏，劉菊芬，李自安，余爭平，朱光旭，潘興華

目的探討Notch1對骨髓源性脂肪祖細胞(BMAPCs)向脂肪細胞分化的影響。方法無菌取SD大鼠股、脛骨骨髓制作細胞懸液，差速貼壁法培養，流式分析檢測細胞表面標志表達；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time qPCR)檢測脂肪相關基因和Notch信號分子表達。Notch1基因沉默實驗分為空載體組和Notch1小RNA干擾組。Western blotting檢測干擾效率；STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit行細胞成脂誘導。結果BMAPCs表達CD34、CD44、CD45及CD90，且表達6種脂肪相關基因及Notch信號分子；成脂誘導促進Notch1 mRNA表達（P＜0.01）；Notch1小RNA干擾抑制Notch1蛋白表達（P＜0.05）。Notch1小RNA干擾組的Cebpa、Lpl和Ppaγ、Slc2a4與Fabp4 mRNA表達均較對照顯著降低，而pread1 mRNA表達顯著增加（P＜0.05～P＜0.01）；Notch小RNA干擾顯著抑制脂肪細胞百分率（P＜0.05）。結論Notch1基因沉默抑制BMAPCs向成熟脂肪細胞分化。

骨髓源性脂肪祖細胞；造血干細胞；間充質干細胞；Notch1

最近本室從骨髓培養出一類細胞，該細胞有一定成骨分化和較強的成脂肪分化能力，表達造血干細胞 （hematopietic stem cells,HSCs）主要標志CD34，也高表達脂肪相關基因，可高效分化為脂肪細胞，我們認為可定義為脂肪祖細胞 (bone marrow adipocyte progenitor cells，BMAPCs)。關于Notch信號在干/祖細胞向脂肪細胞分化中的作用已有部分文獻報道，但是呈現一些比較矛盾的結論。文獻報道Notch1活化促進脂肪源性干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）分化為脂肪細胞[1]，但是另有研究發現Notch信號活化會抑制ADSCs向脂肪細胞分化[2]。本實驗旨在探討Notch1在BMAPCs向脂肪細胞分化中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1～2月齡健康雄性SD大鼠，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號為SCXK(滇)2011-0004，使用許可證號為SYXK（滇）K2013-0011，均喂養于環境適中，飲食良好的環境。優質胎牛血清（FBS，PAA公司），STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit(Gibco)，內皮基礎培養基-2（EBM-2，Lonza），內皮生長因子添加劑（ECGs, Millipore），GoScript反轉錄系統、GoTaqqPCRMaster MiX（Progema公司），熒光標記CD34(Abcam)，CD45、CD44、CD90抗體 (Ebioscience)，Notch 1 siRNA及siRNA Reagent System （Santa Cruz），PCR引物由奧科鼎盛生物有限公司合成。

1.2 BMAPC體外培養 PBS沖洗SD大鼠股、脛骨骨髓，將懸液轉移到離心管，靜置8～10 min后轉移到另一離心管，離心棄上清，以EBM-2(含20% FBS、15 μg/ml ECGs及青、鏈霉素各100 U/ml)培養基吹打混勻，以1×107/cm2接種于培養瓶，37℃、5% CO2條件培養，連續兩次進行細胞懸液轉移培養；對第三次貼壁細胞進行培養，每4 d換液一次，待細胞鋪滿瓶底約80%～90%后，進行傳代，取P3～P5細胞用于流式分析及相關實驗。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測基因表達

按照GoScript反轉錄系統試劑說明，將實驗細胞分為BMAPC組、空載體組和Notch1小RNA干擾組，提取mRNA并進行反轉錄，獲得cDNA，所獲得的cDNA用GoTaqqPCRMaster MiX，按照操作說明進行實時定量PCR測定。取PCR產物進行電泳，Gel Doc 2000圖像掃描儀分析。引物序列見表1。

1.4 基因轉染 取培養的P4代細胞，待細胞長至約90%融合,參照RNA干擾說明書行基因轉染，18 h后去除轉染試劑,換上含正常EBM-2培養基培養72 h后,Western blotting檢測RNA干擾效率。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達 取Notch1干預的細胞，用PBS洗滌，PMSF裂解，將裂解液移至離心管，離心收集上清，蛋白定量、上樣，SDSPAGE電泳后電轉至PVDF膜室溫封閉，加入抗大鼠GAPDH抗體(1∶800)、Notch1(1∶600)，4℃孵育過夜，再與HRP標記的兔抗羊IgG、抗鼠IgG 37℃孵育1 h，顯色后用凝膠成像系統掃描,半定量分析顯影帶，目的蛋白量以GAPDH相對量表示。

1.6 成脂誘導分化 基因轉染48 h后加入新培養液，24 h后棄培養液，加入成脂肪分化誘導液培養，每隔3 d換液，誘導14 d后，用4%多聚甲醛固定后加入油紅O進行染色。DAPI標記細胞核，計算脂肪細胞百分率，計算公式為：脂肪細胞百分率=油紅O染色陽性細胞數÷細胞總數×100%。

表1 實時定量聚合酶鏈式反應引物

1.7 統計學方法 計量資料以Mean±SD表示，應用SPSS10.0統計軟件包進行組間單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMAPCs的生長特征 第三次貼壁細胞培養至第3 d，少部分細胞變為梭形（圖1A），至第5 d，大部分細胞形態均變為梭形或長三角狀（圖1B），至第10 d，細胞呈融合生長狀態（圖1D）。除P0～P2外，P3～P7細胞形態未見明顯變化。培養細胞表達脂肪相關基因包括過氧化物酶體增殖激活受體γ（Ppaγ）、脂肪酸結合蛋白4（fFabp4）、脂蛋白脂肪酶（Lpl)、CCAAT/增強子結合蛋白α（Cebpa）、葡萄糖轉運蛋白4（Slc2a4）以及前脂肪細胞因子1（pread1）(圖1G)。流式分析表明細胞表達CD34、CD44、CD45以及CD90（圖1I）。取P4細胞進行成脂肪分化誘導（圖1H），誘導后第8 d成脂率為（87.2±11.67）%(n=6)。

2.2 成脂分化誘導調節的 Notch1 mRNA在BMAPCs表達 JAG1、2及 Notch1～3均表達于BMAPCs（圖2）。與0 d相比為（1.000±0.241）%，對BMAPCs進行成脂肪分化誘導第2 d，Notch1 mRNA表達顯著增加（2.636±0.375）%（n=4,P＜0.01），到第4 d有所下降（1.495±0.252）%（n=4,P＜0.05）。

圖1 BMAPCs的生長特征

圖2 Notch信號分子在BMAPCs表達以及成脂誘導對Notch1 mRNA在BMAPCs表達的調節作用

2.3 Notch1 RNA干擾下調Notch1蛋白在BMAPCs表達 基因轉染后72 h進行Western blotting檢測，Notch1小RNA干擾組蛋白表達量（39.4±4.2）%較空載體組顯著降低（49.7±5.8）%（n=4,P＜0.05）（圖3）。

圖3 基因轉染72 h后檢測BMAPCs Notch1蛋白表達

2.4 Notch1 RNA干擾調節BMAPCs脂肪分化基因表達及抑制其脂肪細胞分化 成脂誘導至第3 d，可見對照組疑似脂肪細胞數目較Notch siRNA組明顯增加，誘導至第5 d，對照組內疑似脂肪細胞數和油滴大小與Notch siRNA組相差更為明顯 （圖4A）。成脂誘導第5 d，Notch siRNA組的Cebpa、Lpl、Ppaγ、Slc2a4與Fabp4 mRNA(分別為0.87%±0.04%、0.76%± 0.11%、0.81%±0.06%、0.86%±0.08%、0.71%±0.04%）表達均較對照（分別為1.00%±0.04%、1.00%±0.09%、1.00%±0.04%、1.00%±0.07%、1.00%±0.09%）顯著降低，而pread1 mRNA表達（1.16±0.03）%則較對照（1.00± 0.04）%顯著增加（n=4,P＜0.05～P＜0.01）。誘導第5 d(圖4B)，與對照組的 （49.7±5.8）%比較，Notch siRNA組（39.4±4.2）%脂肪細胞百分率顯著降低（n= 4,P＜0.05）。

圖4 Notch1 RNA干擾調節BMAPCs脂肪分化基因表達及抑制其成脂分化

3 討論

本實驗培養的細胞既表達HSCs的主要標志CD34和脂肪相關特異性基因，又可高效分化為脂肪細胞，因此我們將此細胞定義為BMAPCs。實驗表明 Notch信號分子包括配體 JAG1、2以及受體Notch1～3均表達于BMAPCs，成脂肪誘導顯著促進Notch1 mRNA在BMAPCs表達，提示Notch1可能在BMAPCs向脂肪細胞分化中也起促進作用[1]。

本研究結果顯示，Notch1基因沉默顯著影響BMAPCs成脂肪分化能力，誘導至第3 d，在光鏡下觀察到對照組的疑似脂肪細胞數目較Notch siRNA組明顯增加，至第5 d對照組內疑似脂肪細胞數和油滴大小與Notch siRNA組相差更為顯著。與對照相比，Notch1基因沉默顯著抑制Cebpa、Lpl、Ppaγ、Slc2a4和Fabp4，而促進pread1 mRNA表達，Notch siRNA顯著降低脂肪細胞百分率，表明Notch siRNA顯著抑制BMAPCs向脂肪細胞分化。

Notch通路成員作用較為復雜，同一Notch信號分子在不同細胞或同一細胞的不同分化階段功能可能完全不同，如Notch2可能抑制平滑肌細胞增殖，而Notch3卻促進SMCs增殖[3]；即使同一受體在不同類型細胞中作用也有所不同，Notch1在某些腫瘤的是癌基因，但是在其他類型腫瘤中則可能為抑癌基因[4]。既往關于Notch信號在干/祖細胞向脂肪細胞分化中的作用出現的矛盾結論，可能源于并未探討該通路中具體某一受體或配體的詳細作用[5]。本實驗證實Notch1基因沉默抑制BMAPCs向脂肪細胞誘導分化，從一側面證實了Notch1活化促進BMAPCs向脂肪細胞分化，為脂肪組織再生機制提供了部分新的理論基礎。

[1] Ba K,Yang X,Wu L,et al.Jagged-1-mediated activation of notch signalling induces adipogenesis of adipose-derived stem cells[J].Cell Prolif,2012,45(6):538-44.

[2] Osathanon T,Subbalekha K,Sastravaha P,et al.Notch signalling inhibits the adipogenic differentiation of single-cell-derived mesenchymal stem cell clones isolated from human adipose tissue [J].Cell Biol Int,2012,36(12):1161-1170.

[3] Baeten JT,Lilly B.Differential regulation of NOTCH2 and NOTCH3 contribute to their unique functions in vascular smooth muscle cells[J].J Biol Chem,2015,290(26):16226-16237.

[4] Fan X,Mikolaenko I,Elhassan I,et al.Notch1 and notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth[J].Cancer Res, 2004,64(21):7787-7793.

[5] Song BQ,Chi Y,Li X,et al.Inhibition of Notch signaling promotes the adipogenic differentiation of mesenchymal stem cellsthrough autophagy activation and PTEN-PI3K/AKT/mTOR pathway[J].Cell Physiol Biochem,2015,36(5):1991-2002.

Inhibition of adipocyte differentiation of BMAPCs to mature fat cells by Notch1 gene silencing

Wang Jinxiang1,Wang Xiaohua2,Bai Yingying1,Zhou Fang1,Cai Xuemin1,Liu Jufen1,Li Zi'an1,Yu Zhengping3,Zhu Guangxu1,Pan Xinghua11.Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032, China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming, Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming, Yunnan,650032,China;Clinical College of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming Medical University, Kunming,Yunnan,650032,China;2.Material Evidence Identification Center of Chongqing Public Security Bureau Yuzhong District Branch,Chongqing,400013,China;3.Research Institute of Biological Effects of Electromagnetic Radiation,Preventive Medicine College of the Third Military Medical University,Chongqing,400038,China

Objective To explore the effects of Notch1 on the adipocyte differentiation of bone marrow adipocyte progenitor cells(BMAPCs).MethodsThe femoral and tibial bone marrow of SD rats was sampled in a sterile manner to prepare cell suspension, which was cultivated by differential adhesion method.The cell surface marker expression was analyzed and detected by flow analysis; the molecular expression of adipose related genes and Notch signaling was detected by means of real-time qPCR.Notch1 gene silencing experiment was divided into non-carrier group and Notch1 small RNA interference group.The interference efficiency was detected by Western blotting;cell fat induction was conducted by STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit.ResultsBMAPCs expressed CD34,CD44,CD45 and CD90,and six fat-related genes and Notch signaling molecule;fat induction promoted the expression of Notch1 mRNA(P＜0.01);Notch1 small RNA interference inhibited the expression of Notch1 protein(P＜0.05).The levels of Cebpa,Lpl and Ppaγ,Slc2a4 and Fabp4 mRNA in Notch1 small RNA interference group were significantly lower than those in the control group,while the level of pread1 mRNA increased greatly(P＜0.05～P＜0.01);Notch small RNA interferencesignificantly inhibits the percentage of fat cells(P＜0.05).ConclusionNotch1 gene silencing inhibits the BMAPCs from differentiating into mature fat cells.

BMAPC;HSC;MSC;Notch1

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1374-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.007

2016-07-04）

國家科技支撐計劃項目（2014BI01B00）；國家自然科學基金（No.81170316）；云南省科技計劃項目（20111HB050，2013DA004）

650032昆明，成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心、干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合實驗室、云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室、昆明醫科大學成都軍區昆明總醫院臨床學院（王金祥，白盈盈，周 芳，蔡學敏，劉菊芬，李自安，朱光旭，潘興華）；重慶市公安局渝中區分局物證鑒定所（王小華）；第三軍醫大學預防醫學院電磁輻射生物學效應研究所（余爭平）

朱光旭：E-mail:zhguxu@aliyun.com；潘興華:E-mail:panxinghua@aliyun.com