高效液相色譜－電化學檢測器測定富硒酵母中硒代蛋氨酸含量*

陳榮祥，保玉心

(1．遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563000；

2．貴州省遵義市理化分析測試工程技術研究中心，貴州 遵義 563000)

高效液相色譜－電化學檢測器測定富硒酵母中硒代蛋氨酸含量*

陳榮祥1，2，保玉心1，2

(1．遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563000；

2．貴州省遵義市理化分析測試工程技術研究中心，貴州 遵義 563000)

目的 建立測定富硒酵母中的硒代蛋氨酸含量的高效液相色譜－電化學檢測器檢測法。方法 色譜柱采用Agilent Eclipse plus C18柱(150 mm×3．0 mm，3．5 μm)，流動相為100 mmol／L檸檬酸緩沖鹽（pH＝2．75，含300 mg／L辛烷基磺酸鈉）－甲醇（85∶15），檢測電壓為500 mV(ECD1)和700 mV(ECD2)。結果 硒代蛋氨酸質量濃度在1～300 μmol／L范圍內與峰面積線性關系良好（r2＝0．999 6），檢出限為0．30 μmol／L，加樣回收率為101．30%，RSD為2．30%（n＝6）。結論 該方法操作簡便，靈敏度高，重復性好，可用于富硒酵母中硒代蛋氨酸的檢測。

高效液相色譜－電化學檢測器；富硒酵母；硒代蛋氨酸

硒是人體重要的微量元素，具有較強的抗癌活性[1]。食物中硒的存在形式分為無機硒和有機硒，動物體對有機硒的利用率遠大于無機硒[2]。富硒酵母是常見補充硒的保健產品，國內外均有大量產品在市場銷售。其中硒代蛋氨酸是富硒酵母中有機硒的主要成分，占有機硒含量的65%以上[3]。目前多采用色譜分離法檢測食品中硒代蛋氨酸，此方法具有高選擇性和高靈敏度的優點。色譜分離方法包括氣相色譜法[4－5]、液相色譜法、毛細管電泳[6－7]等。其中液相色譜法是最主要的分離方法，與其相匹配的檢測方法，如液相色譜－電感耦合等離子質譜法[3，8－9]、液相色譜 －原子熒光法[10－11]、液相色譜－熒光檢測法[12－13]等。其中電感耦合等離子質譜和原子熒光對硒的檢測選擇性較好，但這兩類檢測器和液相聯用尚未普及，熒光檢測器的靈敏度較高，但對硒代蛋氨酸的檢測選擇性較差。因而，電化學檢測器（ECD）具有高靈敏性和低檢測限，在痕量組分分析中具有明顯優勢。硒代蛋氨酸和蛋氨酸結構類似，都在一定條件下容易氧化，因而可以采用高靈敏、高選擇性的電化學檢測器進行檢測。目前，國內外尚未見利用液相色譜－電化學檢測器進行硒代蛋氨酸檢測的報道。為此，筆者建立了快速、靈敏的高效液相色譜（HPLC）－ECD方法，用于富硒酵母中硒代蛋氨酸的測定。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜（Thermo fisher），包括ISO 3100型等度泵，WPS 3000 TBSL型自動進樣器，CoulochemⅢ型電化學檢測器（含6011串聯雙電極檢測池），工作站為Chromeleon 6．8；PE－50型pH計（Mettler Toledo）；AL104型電子天平（萬分之一，Mettler toledo）；Elix超純水儀（Merck Millipore）。

1．2 試藥

富硒酵母粉(市售，批號為201505)；富硒酵母片(市售，批號為 435568)；普通酵母粉(市售，批號為20150227)；硒代蛋氨酸(含量為97%，批號為L530N44，北京百靈威科技有限公司)；Tris(分析純)、脂肪酶(批號為45212)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色譜純)、檸檬酸(ACS級)、檸檬酸鈉(ACS級)、辛烷基磺酸鈉(ACS級)、鏈霉蛋白酶(批號為SLB5636V)均購自Sigma－Aldrich公司；實驗室自制超純水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipse plus C18柱（150 mm×3．0 mm，3．5 μm）；柱溫：35℃；流動相：100 mmol／L檸檬酸緩沖鹽（pH＝2．75，含 300 mg／L辛烷基磺酸鈉）－甲醇溶液（85∶15）；流速：0．4 mL／min；進樣量：5 μL；自動進樣器溫度：4℃；檢測池電壓：500 mV（ECD1）和700 mV（ECD2）。

2．2 溶液制備

對照品溶液：準確稱取硒代蛋氨酸標準品，用0．1 mol／L鹽酸溶解、定容并搖勻后，配制成10mmol／L的標準貯備液，保存于－20℃的冰箱中。使用前將標準貯備液用流動相稀釋，配制成一系列不同濃度的對照品溶液。

供試品溶液[14]：準確稱取0．5 g富硒酵母粉或粉碎后的富硒酵母片，加入30 mmol／L pH 7．5的tris－HCl緩沖溶液5 mL（含 20 mg鏈霉蛋白酶和10 mg脂肪酶），37℃下震蕩20 h。2 500 r／min離心10 min，上清液經0．22 μm濾膜過濾，即得。陰性對照品溶液：取普通酵母粉，按供試品溶液制備方法處理，即得。

2．3 方法學考察

專屬性試驗:按擬訂色譜條件，取硒代蛋氨酸對照品溶液、富硒酵母酶解液及普通酵母酶解液各5 μL進樣。結果硒代蛋氨酸對照品溶液與供試品溶液色譜相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照品溶液在此無對應色譜峰。色譜圖見圖1。

線性關系考察：將硒代蛋氨酸標準貯備液用流動相逐級稀釋為濃度為 1．0，5．0，10．0，50．0，100．0，300．0 μmol／L的標準工作液，每個濃度的標準溶液平行進樣3次，以峰面積(Y，nA·min）為縱坐標、樣品濃度(X，μmol／L）為橫坐標繪制標準曲線。硒代蛋氨酸的回歸方程為 Y＝5．191 0 X＋0．247 5，r2＝0．999 6(n＝6)。結果表明，硒代蛋氨酸濃度在1～300 μmol／L范圍內與峰面積呈良好的線性關系。以信噪比（S／N）＝3計算本方法的檢出限為0．30 μmol／L。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣 5次，記錄峰面積。結果的 RSD為0．94%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

圖1 專屬性試驗色譜圖

穩定性試驗：硒代蛋氨酸可在直流氧化模式下測定，說明具有較強的還原性，因此在自然條件下也有可能會被氧化。為了研究樣品穩定性對研究結果的影響，本研究中將自動進樣器溫度設置為4℃，采用同一份(濃度為50 μmol／L標準溶液)樣品重復進樣，得到峰面積隨時間的變化規律。結果的 RSD小于2．00%，表明供試品溶液于4℃下在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：精密稱取同一批樣品，按2．2項下方法制備供試品溶液5份，分別進樣測定含量。結果硒代蛋氨酸含量為92．97 μg／g，RSD為2．1%(n＝5)，表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：在已知硒代蛋氨酸含量的樣品中進行回收率試驗，3個添加水平分別為 30．0，50．0，100．0 μmol／L，用優化后的處理方法對硒代蛋氨酸進行含量測定，每個濃度平行進樣6次，計算回收率。結果見表1。

2．4 樣品含量測定

按本方法對富硒酵母粉和富硒酵母片分別進行測定，結果二者硒代蛋氨酸的平均含量分別為1 206．56 μg／g和92．97 μg／g(n＝3)。

表1 硒代蛋氨酸加樣回收試驗結果（n＝6）

3 討論

3．1 流動相選擇

和其他的檢測器有所不同，使用電化學檢測器時流動相中需要有一定濃度的緩沖鹽。因而通常可以調節流動相的pH來改變結構中含有酸堿基團化合物的保留時間。酵母酶解液中氨基酸的含量豐富，其中不乏在電化學檢測器中有響應的氨基酸成分，如酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸等。通過優化流動相條件，可以將富硒酵母酶解液中的硒代蛋氨酸和干擾組分分離。

由于氨基酸在反相C18柱中保留能力較弱，因此加入了一定濃度的辛烷基磺酸鈉來增加色譜柱的分離能力。通過在調節pH，0～600 mg／L范圍內調節辛烷基磺酸鈉的濃度，最終確定流動相為100 mmol／L檸檬酸緩沖鹽（pH＝2．75，含300 mg／L辛烷基磺酸鈉－甲醇（85∶15）溶液。

3．2 檢測電壓選擇

在優化的流動相條件下，將檢測池的電壓由0 mV逐漸升高至800 mV，同一份樣品重復進樣，可見峰高隨電壓的變化而變化，提示在電壓低于500 mV時，硒代蛋氨酸幾乎不氧化，而700 mV時氧化完全。故試驗中將ECD1的檢測電壓設為500 mV，用于氧化樣品中的部分，干擾組分，以降低噪音；將ECD2的電壓設為700 mV，用于硒代蛋氨酸的檢測。

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Determination of Selenomethionine in Selenium－Enriched Yeast by HPLC－Electrochemical Detector

Chen Rongxiang1,2,Bao Yuxin1,2
(1．Center for Medical and Biological Research,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou,China 563000;
2．Zunyi Municipal Center for Physical and Chemical Analysis and Testing Technology,Zunyi,Guizhou,China 563000)

Objective To establish an HPLC－electrochemical detection method for the determination of selenomethionine in seleniumenriched yeast．M ethods The column was an Agilent Eclipse plus C18column(150 mm×3．0 mm,3．5 μm)．100 mmol／L citrate buffer (pH＝2．75,containing 300 mg／L1－Octanesulfonic acid sodium salt)－methanol(85∶15)was used as the mobile phase and the detection voltage was set at 500 mV(ECD1)and 700 mV(ECD2)．Results Selenomethionine showed good linearity in the range of 1－300 μmol／L(r2＝0．999 6),the detection limit was 0．30 μmol／L,and the recovery rate was 101．30%,RSD was 2．30%(n＝6)．Conclusion The method is simple,sensitive,reproducible,which can be used for the determination of selenomethionine in seleniumenriched yeast．

HPLC－electrochemical detector;selenium－enriched yeas;selenomethionine

R927．2；R977．4

A

1006－4931(2016)23－0068－03

陳榮祥(1984－)，男，博士研究生，講師，研究方向為色譜分析，(電子信箱)chenrongxiang2014＠163．com；保玉心(1979－)，女，碩士研究生，副教授，研究方向為色譜分析，本文通訊作者，(電子信箱) baoyuxinzmc＠163．com。

2016－08－01)

*遵義醫學院博士啟動基金，項目編號：F－798；貴州省科技廳基礎研究項目，項目編號：黔科合基礎〔2016〕1172。