高效液相色譜法測定復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏中氫化可的松和聯(lián)苯芐唑含量

曹月霞，蔡 果

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210042）

高效液相色譜法測定復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏中氫化可的松和聯(lián)苯芐唑含量

曹月霞，蔡 果

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210042）

目的 建立復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏中氫化可的松和聯(lián)苯芐唑含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 色譜柱采用Waters Symmetry C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），流動相為甲醇－水，梯度洗脫，流速為1．0 mL／min，檢測波長為242 nm。結(jié)果 氫化可的松進樣質(zhì)量濃度在40～200 μg／mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r＝0．999 9），平均回收率為98．48%，RSD為1．07%（n＝9）；聯(lián)苯芐唑在40～200 μg／mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r＝0．999 9)，平均回收率為99．43%，RSD為0．93%（n＝9）。結(jié)論 該方法簡便準確，重復(fù)性好，可用作復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏中氫化可的松和聯(lián)苯芐唑的含量控制。

氫化可的松；聯(lián)苯芐唑；高效液相色普法；含量測定

復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏是我院自行研制的自制制劑，主要成分為氫化可的松和聯(lián)苯芐唑。聯(lián)苯芐唑是一種氮取代、不含鹵素的咪唑類局部抗真菌藥，抗菌譜廣，對皮膚癬菌、酵母菌、曲霉菌、雙相真菌均有較強的抑制作用，對某些革蘭陽性菌也有抗菌作用[1]。氫化可的松為不含鹵素的弱效糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗過敏和免疫抑制作用，有顯著的抗瘙癢、抗增生作用，用藥部位的皮膚萎縮、毛細血管擴張、色素沉著等不良反應(yīng)較少[2]。氫化可的松弱效激素與抗真菌藥的聯(lián)合應(yīng)用，可彌補市場眾多單方制劑的不足，臨床廣泛應(yīng)用于皮膚敏感部位皮炎、濕疹合并真菌感染的治療，且療效良好。為提高醫(yī)院自制制劑質(zhì)量標準，筆者用高效液相色譜（HPLC）法同時測定兩種主藥成分含量，方法簡便，結(jié)果準確，可用于該制劑的質(zhì)量控制?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1525型高效液相色譜系統(tǒng)，2487型紫外檢測器，Breeze型色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Waters公司）；AE－240型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1．2 試藥

聯(lián)苯芐唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號為100326－201302，純度為98．6%）；氫化可的松對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 100152－200206，純度為100%）；復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏（自制制劑，批號為20160114，20160527，20160616）；輔料均為藥用規(guī)格，甲醇為色譜純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）－水（B），梯度洗脫，見表1；流速：1．0 mL／min；檢測波長：242 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫表

2．2 溶液制備

對照品溶液：稱取氫化可的松、聯(lián)苯芐唑?qū)φ掌犯?0．00 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為100 μg／mL的氫化可的松和100 μg／mL的聯(lián)苯芐唑?qū)φ掌啡芤骸?/p>

供試品溶液：取供試品適量（相當(dāng)于聯(lián)苯芐唑和氫化可的松各10 mg），精密稱定，置于燒杯中，加甲醇約20 mL，水浴加熱，攪拌使其溶解，全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，冷卻至室溫加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例配置不含聯(lián)苯芐唑和氫化可的松的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得。

2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：按擬訂色譜條件，分別進樣對照品溶液，并記錄色譜圖見圖1。結(jié)果表明，供試品溶液色譜圖中，氫化可的松峰與聯(lián)苯芐唑峰分離度良好，保留時間分別為10．3 min，26．6 min，理論板數(shù)分別為2 750，800，峰型良好。

空白干擾試驗：按擬訂色譜條件，進樣陰性樣品溶液，結(jié)果顯示在氫化可的松和聯(lián)苯芐唑?qū)φ掌啡芤荷V峰處無干擾峰，表明制劑中其他藥用輔料成分對氫化可的松和聯(lián)苯芐唑的測定無干擾(見圖1)。

線性關(guān)系考察：精密稱取氫化可的松對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得200 μg／mL貯備液；精密吸取該溶液2．0，4．0，6．0，8．0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液及貯備液按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。以氫化可的松質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、平均峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為 A＝21 047C＋43 250，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，氫化可的松質(zhì)量濃度在40～200 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。精密稱取聯(lián)苯芐唑?qū)φ掌?0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得200 μg／mL貯備液；精密吸取該溶液2．0，4．0，6．0，8．0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液及貯備液按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。以聯(lián)苯芐唑的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、平均峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為 A＝41 709C＋90 829，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，聯(lián)苯芐唑質(zhì)量濃度在40～200 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗：取同一對照品溶液，重復(fù)進樣5次，記錄色譜圖。結(jié)果氫化可的松和聯(lián)苯芐唑的峰面積 RSD分別為1．54%（n＝5）和1．09%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，于室溫下放置0，2，4，6，8 h，進樣并記錄色譜圖。結(jié)果氫化可的松和聯(lián)苯芐唑的峰面積 RSD分別為1．56%和1．44%（n＝5）。表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗：取同一批樣品適量，共6份，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，結(jié)果氫化可的松和聯(lián)苯芐唑的含量 RSD分別為1．47%和1．37%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：分別按照樣品標示量的 80%，100%，120%，精密稱取氫化可的松和聯(lián)苯芐唑原料藥，按處方比例制得樣品，按供試品溶液制備方法制備高、中、低不同濃度的供試品溶液，各3份，照擬訂色譜條件測定。結(jié)果見表2。

2．4 樣品含量測定

取不同批號樣品，按外標法以峰面積計算其含量。結(jié)果見表3。

3 討論

復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏為我院自制制劑，由于處方中基質(zhì)與藥物互相干擾，很難以常規(guī)檢測方法同時對兩種主藥成分進行含量測定，根據(jù)《中國藥典》方法及文獻[3－9]的含量測定方法，或只能測得單一成分的含量，或不能排除基質(zhì)成分對試驗結(jié)果的影響，兩主藥及基質(zhì)成分不能有效分離，不能達到同時檢測的目的。文獻[10]雖能用薄層色譜法鑒別復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏中兩種主藥成分，但對其含量不能確認。

提取條件選擇：參考文獻[11]“加無水乙醇30 mL，在水浴上加熱使溶解，再置冰浴中冷卻，濾過。如此提取3次，濾液并人100 mL燒杯中，于水浴上揮干用流動相溶解，放冰箱中冷藏過夜，迅速過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，即得”。提取時間更短，操作更加簡便，更適合用于醫(yī)療機構(gòu)自制制劑的快速檢測。對供試品的提取次數(shù)進行比較，用甲醇分別進行1，2，3次提取，取供試液進樣。結(jié)果表明，提取次數(shù)對結(jié)果影響甚微，從節(jié)約成本角度考慮，選擇甲醇提取1次。

表2 復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

表3 復(fù)方聯(lián)苯芐唑乳膏含量測定結(jié)果（%，n＝3）

波長選擇：根據(jù)《中國藥典（二部）》方法，氫化可的松的最大吸收波長為 242 nm[12]766，聯(lián)苯芐唑的最大吸收波長為 254 nm[12]1263。由于氫化可的松于 254 nm波長處吸收較小，聯(lián)苯芐唑于242 nm波長處吸收較大，故選擇242 nm作為測定波長，兩種主藥成分峰面積均較大，檢測靈敏度較高。

流動相選擇：參考文獻[13]，所選用的流動相為磷酸鹽緩沖液－乙腈－甲醇(25∶15∶60)等度洗脫，或水相－甲醇(醋酸銨26 g和三乙胺37 mL，加水至1 000 mL，冰醋酸調(diào)pH至4．0)(45∶55)為流動相[14]。本試驗中對流動相的比例進行考察，試驗考察了78%，80%，82%，85%比例的甲醇對試驗結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，甲醇比例的變化對聯(lián)苯芐唑保留時間影響較大，比例越大，則聯(lián)苯芐唑的保留時間越短；然而比例過大，則各組有效成分不能有效分離，且梯度變化使基線較不平穩(wěn)。故而最終選擇80%比例的甲醇，梯度洗脫，基質(zhì)與兩主藥成分可有效分離，主藥保留時間也較為合適。

綜上所述，該試驗所用方法充分考慮了制劑制備工藝和兩主藥成分的性質(zhì)，優(yōu)化了實驗操作步驟，可有效排除基質(zhì)峰對兩主藥色譜峰的影響，等度不能把基質(zhì)和兩組分有效地分離，最終選用本法進行梯度洗脫，最終達到滿意的分離效果。所建立的方法操作簡便，節(jié)約成本，經(jīng)濟效率，可作為本醫(yī)療機構(gòu)該制劑快速檢測的方法。

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Content Determination of Hydrocortisone and Bifonazole in Compound Bifonazole Cream by HPLC

Cao Yuexia,Cai Guo
(Chinese Academy of Medical Sciences·Peking Union Medical College Dermatological Hospital,Nangjing,Jiangsu,China 210042)

Objective To establish an effective HPLC method for the content determination of hydrocortisone and bifonazole in Compound Bifonazole Cream．M ethods The separation was performed on Waters Symmetry C18(250 mm×4．6 mm,5 μm)with different proportions of methanol－water at a flow rate of 1．0 mL／min with gradient elution,and UV detection was set at 242 nm．Results A good linearity was obtained over the range of 40－200 μg／mL(r＝0．999 9)for hydrocortisone and 40－200 μg／mL(r＝0．999 9)for bifonazole,respectively．The average recovery rates of these two components were 98．48% with RSD＝1．07%(n＝9)and 99．43% with RSD＝0．93%(n＝9)．Conclusion The method is simple,accurate and reproducible,which can be used for the content control of the preparation．

hydrocortisone;bifonazole;HPLC;content determination

R927．2；R986

A

1006－4931(2016)23－0065－03

曹月霞（1992－），女，江蘇南京人，藥師，主要從事醫(yī)院藥劑科工作，(電子信箱)1525972154＠qq．com。

2016－08－01；

2016－09－24)