高效液相色譜法監測癲癇患兒血清中左乙拉西坦的血藥濃度

李 容，王 剛，呂鳳俊

（1．重慶市涪陵中心醫院，重慶 408000； 2．重慶醫科大學附屬兒童醫院，重慶 400014）

高效液相色譜法監測癲癇患兒血清中左乙拉西坦的血藥濃度

李 容1，王 剛2，呂鳳俊2

（1．重慶市涪陵中心醫院，重慶 408000； 2．重慶醫科大學附屬兒童醫院，重慶 400014）

目的 建立測定抗癲癇藥左乙拉西坦血藥濃度的高效液相色譜（HPLC）法。方法 根據液－液萃取法，利用乙酸乙酯從血清中提取出左乙拉西坦，于40℃恒溫水浴中經氮氣恒流吹干富集濃縮，再用甲醇復溶后進樣25 μL；流動相為磷酸鹽緩沖液（pH＝4．0）－乙腈（93∶7，V／V），流速1．0 mL／min，柱溫為40℃，色譜柱采用島津RP－C18柱（150 mm×3．9 mm，5 μm），檢測波長為210 nm。結果 左乙拉西坦線性回歸方程為 Y＝46 853 X＋23 250，r＝0．999 8(n＝5)，質量濃度在5．120～51．20 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。結論 該方法驗證符合血清樣品的測定要求，可用于臨床血藥濃度測定及藥代動力學研究。

高效液相色譜法；左乙拉西坦；血藥濃度；血清

左乙拉西坦（levetiracetam，LEV）是第2代乙酰膽堿激動劑，是吡咯烷酮衍生物，化學結構不同于傳統的抗癲癇藥物，結構和作用機制也與其他抗癲癇藥物不同，主要是選擇性地抑制癲癇樣突發放電的超同步性和癲癇發作的傳播而發揮作用，經口服吸收迅速，體內少部分通過水解酶的乙酰化代謝轉化失活，大多以原形藥經腎臟排出體外；其具有選擇性預防局限性和原發全身性癲癇的獨特藥理作用，耐受性良好，藥物相互作用低，是一種新型廣譜抗癲癇藥物，具有廣闊臨床應用前景。LEV已于2000年4月獲得美國食品藥物管理局（FDA）批準上市，于2007年引入國內，用于癲癇部分性發作和全身性發作。LEV治療癲癇，具有顯著的臨床效果與臨床應用價值[1]。參考LEV體內藥物濃度監測相關的文獻[2－4]，結合本實驗室條件，建立LEV的血清藥物濃度測定的高效液相色譜方法，現報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器

高效液相色譜儀：日本島津 Shimadzu系列產品（LC－10AT，SPD－10A，SCL－10A，CTP－10AS）；Shimadzu AUW120型電子天平（日本島津公司）；PHS－3C型精密PH計（上海雷磁儀器廠）；高速離心機（ABBOTT Made in Germany CAT）；YKH－I型渦旋混合器（江西醫療器械廠）。

1．2 試藥

左乙拉西坦對照品（純度≥99．9%，CAT．NO1359404 USP TOCKVILLE，批號為FOH295）；乙腈、甲醇為色譜醇，乙酸乙酯（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號為2015111801）；磷酸(分析純，重慶川東化工＜集團＞有限公司，批號為20150801)；磷酸二氫鈉（二水，分析純，成都化學試劑廠，批號為861128)，磷酸氫二鈉(分析純，重慶川東化工＜集團＞有限公司，批號為20101101)。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：島津RP－C18柱（150 mm×3．9 mm，5 μm）；柱溫：40℃ ；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH＝4．0）－乙腈（93∶7，V／V）；流速：1．0 mL／min；檢測波長：210 nm；進樣量：25 μL。

2．2 溶液配制

對照品貯備液：稱取LEV 512．0 mg，精密稱定，用甲醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得512．0 μg／mL的LEV溶液，作為對照品貯備液。

對照品溶液：精密量取貯備液適量，分別用甲醇稀釋使成 51．20，102．40，204．80，409．60，512．0 μg／mL的系列對照品溶液。

2．3 模擬生物樣品處理

分別精密移取上述系列質量濃度對照品溶液20．0 μL，精密加入空白血清180．0 μL，置10 mL尖底刻度玻璃具塞離心管中，混勻，精密加入乙酸乙酯3．00 mL，渦旋振蕩1 min，2 000 r／min離心10 min，精密移取上清液2．50 mL于5 mL尖底刻度玻璃具塞離心管中，于40℃恒溫水浴中氮氣恒流吹干，加入甲醇100．0 μL復溶，搖勻，取上清液25 μL進樣。取200．0 μL空白血清，同法處理，進樣作空白對照。

2．4 方法學考察

專屬性試驗：按擬訂色譜條件進樣測試。結果LEV的保留時間為7．787 min（n＝5），且血清中內源性物質對其無干擾，見圖1。

干擾試驗：根據癲癇患兒臨床可能聯合用藥的情況，制備含卡馬西平、氯硝西泮、拉莫三嗪、奧卡西平、硝西泮、苯巴比妥對照品的血清臨床模擬樣本，按2．3項下方法進行模擬血清樣本處理。干擾試驗結果見圖2。可見，與LEV可能聯用藥物CBZ，CNP，LTG，OXC，NP，PB對LEV的測定基本無影響。

標準曲線制備：取出－20℃冷凍空白血清，常溫融化，精密移取180．0 μL于10 mL尖底刻度玻璃具塞離心管中，加入系列質量濃度的LEV溶液20．0 μL，配成血清中LEV質量濃度依次為5．120，10．240，20．480，40．960，51．20 μg／mL的對照品溶液，依次加入提取液乙酸乙酯3．00 mL，渦旋振蕩1 min，2 000 r／min離心10 min，取上清液 2．50 mL，于 5 mL尖底刻度玻璃具塞離心管中，40℃水浴下，氮氣恒流吹干，精密移取100．0 μL甲醇復溶，進樣。以LEV的峰面積對相應的質量濃度進行線性回歸，得線性回歸方程 Y＝46 853 X＋23 250，r＝0．999 8(n＝5)。結果表明，LEV質量濃度線性范圍5．120～51．20 μg／mL。

回收試驗：配制LEV血清質量濃度分別為10．240，20．480，40．960 μg／mL的模擬血清生物樣品，并按2．3項下方法處理，進樣，測定藥物峰面積，根據標準曲線計算得濃度，并計算方法回收率。結果見表1。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖

圖2 干擾試驗高效液相色譜圖

精密度試驗：配制高、中、低質量濃度分別為51．20，30．720，5．120 μg／mL的模擬血清樣品，均按2．3項下方法處理，日內連續測定高、中、低質量濃度各2組的峰面積，得到峰面積，根據標準曲線計算日內精密度；日間連續測定5 d高、中、低質量濃度的模擬生物樣品，根據標準曲線計算日內、日間精密度。結果見表2。

表1 LEV回收試驗結果(n＝5)

穩定性考察：分別精密移取系列質量濃度為128．0，128．0，256．0，256．0，512．0，512．0 μg／mL的20．0 μL LEV，各精密加入180．0 μL空白血清，置10 mL玻璃刻度具塞離心管中，按2．2項下處理方法進行處理，考察于－20℃低溫保存4 d、反復凍融3次的穩定性，見表3。

2．5 臨床標本測定

取臨床血標本，2 000 r／min離心15 min，取上清液200．0 μL，置 10 mL刻度玻璃具塞離心管中，在氮氣揮干裝置下加入3．00 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，2 000 r／min離心 10 min，再在氮氣揮干裝置下取2．50 mL，置5 mL刻度玻璃具塞離心管中，把離心管放入40℃水浴鍋中，小心用恒流氮氣揮干，再加入100．0 μL甲醇復溶，進樣20．0 μL。

本次試驗臨床標本來源：來自于測定奧卡西平（OXC）、硝西泮（NP）、氯硝西泮（CNP）、丙戊酸（VPA）、妥泰血藥濃度的臨床患兒，通過詢問患兒家屬服藥情況，得知患兒同時服用LEV，于是收集臨床標本，共計11例，收集好標本保存于－20℃的冰箱中。取出冷凍標本，按上述方法處理測定，測定結果見表4。

表2 LEV的精密度試驗結果(n＝5)

3 討論

3．1 LEV藥物監測（TDM）

LEV作為新藥在中國上市，在兒科治療中沿用中國成人參數是不科學的，需要建立兒童群體藥代動力學模型指導兒童用藥。國際TDM抗癲癇藥物治療指南認為，在特殊人群（如兒童、老年人和孕婦）服用癲癇藥物時有必要對所用藥物進行TDM；抗癲癇藥物的劑量或劑型改變、聯合用藥需要做TDM；服用抗癲癇藥物的患者有肝腎疾病或胃腸道疾病時也需要做TDM。

LEV抗癲癇常用于兒童，常與其他抗癲癇藥物聯用。本試驗中收集的11例癲癇病患兒均為聯合用藥。根據癲癇患兒臨床可能聯合用藥的情況，制備含 CBZ，CNP，LTG，NP，MHD，PB對照品的臨床血清模擬樣本，進行干擾試驗，結果表明，CBZ，CNP，LTG，NP，MHD，PB幾乎無色譜吸收，故聯合用藥對LEV測定幾乎無干擾。本研究中臨床標本分兩次測定，第1次測定前6例，測定結果在5．38～12．57 μg／mL；第2次測定后5例，結果在5．28～7．95 μg／mL，有1例未測出，可能是患兒家屬描述錯誤。本研究中收集的11例患兒都是聯合用藥，無單獨用LEV治療患兒，對LEV劑量與血藥濃度相關分析，由表4可知，聯合用藥時LEV用藥劑量與血藥濃度間相關性不大。

表3 LEV 反復凍融測定結果

3．2 萃取液選擇

LEV易溶于水、乙醇、三氯甲烷等，乙腈中溶解，微溶于乙酸乙酯(在一定條件下，100 g乙酸乙酯溶解0．01～0．1 g LEV)，以溶解度為0．01 g計算，3 mL乙酸乙酯能溶解LEV約為300 μg。本試驗中的測定限性范圍遠小于300 μg，且乙酸乙酯對大多數藥物的溶解性較好，易揮發，毒性小，液－液萃取較完全。采用乙酸乙酯，有利于LEV從血樣中充分提取，而且乙酸乙酯位于萃取層的最上層，有利于吸取分層液的最上部，避免引入過多的內源性物質干擾測定[5]。

表4 11例服用LEV患兒服藥情況及測定結果

3．3 流動相選擇

流動相為甲醇－水（體積比20∶80）[4]，進樣20 μL，得到的峰形較寬，出峰時間約為3．3 min，出峰太早，臨床標本中內源性物質干擾大。調整流動相比例為甲醇－水（15∶85），進樣20 μL，出峰時間約為5 min，得到的峰形仍較寬，仍可考慮臨床標本內源性物質會干擾。再調整進樣量為 10 μL，流動相比例為甲醇 －水（15∶85），此時峰形稍好，出峰時間約為5 min，繼續考慮臨床標本內源性物質干擾大。流動相為磷酸鹽緩沖液[磷酸氫二鈉7．0 g，磷酸二氫鈉（二水）[2]2．0 g，用溫水溶解，加水至2 000 mL，用磷酸調節pH至4．0）－乙腈（90∶10），進樣25 μL，出峰時間約為5．6 min，峰形較好，但目標峰前有一小峰分離不好，于是把流動相磷酸鹽緩沖液與乙腈比例調整為93∶7，其他條件不變，得到的峰較對稱，峰形較好，出峰時間約為7．8 min，臨床標本內源性物質干擾幾乎沒有。

3．4 干擾試驗、質控試驗

采用只服用丙戊酸（VPA）的患兒血清配制模擬標本，由丙戊酸的化學結構可知，其無紫外吸收特征，并且每次都做空白對照，故排除了內源性物質的干擾。

LEV是一種新型抗癲癇藥物，可使難治性偏頭痛患者頭痛發一頻率下降50%以上[6]。LEV聯合氟桂利嗪預防頑固性偏頭痛能更好地改善顱腦血流動力學，增強臨床療效，雖有嗇不良反應的趨勢，但ADR可控[7]。

本試驗中監測11例LEV患兒的血藥濃度，其血藥濃度范圍為5．28～12．57 μg／mL，與Lancelin等[8]報道LEV有效血藥濃度范圍為12～46 μg／mL[3]有較大的差異，是否為聯合用藥等原因所致還有待進一步深入研究。

[1]金 超．LEV治療小兒癲癇80例及智力分析[J]．中國藥業，2015，24（9）：14－16．

[2]王 剛，張君梅，易曉燕，等．高效液相色譜法測定癲癇患兒血清中左乙拉西坦的濃度[J]．中國新藥與臨床雜志，2011，30(6):476－480．

[3]周春華，張志清，何文娟，等．高效液相色譜法測定左乙拉西坦血藥濃度[J]．河北醫科大學學報，2014，35(2):170－172．

[4]王慧穎，魏敏吉，王云秀，等．高效液相色譜法測定左乙拉西坦血藥濃度[J]．兒科藥學雜志，2010，16（4）：34－36．

[5]肖擁軍，羅湘冀 ．高效液相色譜法測定左乙拉西坦片的含量[J]．廣東藥學院學報，2005，21(6):687－688．

[6]Krusz JC．Levetiracetam sa prophylaxis for resistant headaches[J]．Cephalalgia，2001，21(4):2－12．

[7]李運良．左乙拉西坦聯合氟桂利嗪預防頑固性偏頭痛47例[J]．中國藥業，2015，24（1）：80－81．

[8]Lancelin F，Franchon E，Kraoui L，et al．Therapeutic drug monitoring of levetiracetam by high－performance liquid chromatography with photodiode array ultraviolet detection:preliminary ovservations on correlation between plasma concentration and clinical response in patients with refractory epilepsy[J]．Ther Drug Monit，2007，29(5):576－783．

Determination of Levetiracetam in Serum of Children with Epilepsy by HPLC

Li Rong1,Wang Gang2,Lü Fengjun2
(1．Chongqing Fuling Central Hospital,Chongqing,China 408000;
2．Children′s Hospital Affiliated to Chongqing Medical University,Chongqing,China 400014)

Objective To establish an HPLC method for the serum concentration of antiepileptic drug levetiracetam．M ethods Levirairacetam was extracted from serum by ethyl acetate using liquid－liquid extraction method,and was concentrated in a constant temperature water bath at 40℃ by constant nitrogen drying．After reconstituted with methanol,25 μL was injected．The RP－C18column(Shimadzu 150 mm×3．9 mm,5 μm)was used;the mobile phase was phosphate buffer(pH＝4．0)－acetonitrile(93∶7,V／V),the detection wavelength was set at 210 nm,at a flow rate of 1．0 mL／min and the column temperature was 40℃．The chromatographic peak of levetiracetam was recorded,and the linear regression equation was made according to the peak area and fitted concentration．Results The linear regression equation was Y＝46 853 X＋23 250(r＝0．999 8)．The linear range was 5．120－51．20 μg／mL．Conclusion The method is proved to be suitable for the determination of serum samples,which can be used for the serum concentration in the clinic and in the pharmacokinetics study．

HPLC;levetiracetam;serum concentration;serum

R969．1；R971＋．6

A

1006－4931(2016)23－0028－05

2016－08－11；

2016－09－20)