Shank1在原發性肝細胞性肝癌組織中的表達及意義

谷鋒，楊繼宏，李琮，張洪安，康明，段文都，劉巖

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2華北油田總醫院)

?

Shank1在原發性肝細胞性肝癌組織中的表達及意義

谷鋒1，楊繼宏2，李琮1，張洪安1，康明1，段文都1，劉巖1

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2華北油田總醫院)

目的 觀察Shank家族成員Shank1在原發性肝細胞性肝癌(HCC)組織中的表達變化，分析其與HCC臨床病理特征及肝癌預后的關系。方法 收集75例HCC患者術后HCC癌及癌旁組織,采用免疫組化染色、Western blotting和RT-PCR方法分別檢測Shank1蛋白及mRNA在癌和癌旁組織中的表達，分析Shank1表達與肝癌患者臨床病理特征的關系。結果 免疫組化染色結果顯示，HCC癌組織中Shank1表達較癌旁組織明顯下調，差異有統計學意義(P<0.001)；Western blotting檢測結果顯示HCC癌組織中Shank1蛋白表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.05)。Shank1在HCC癌組織中的表達下調與患者性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結是否轉移無顯著相關(P均>0.05)，但與臨床分期有關(P<0.05)。結論 Shank1在HCC癌組織中表達降低，且與臨床分期有關；檢測Shank1蛋白表達有助于HCC病情判斷。

肝腫瘤；肝細胞性肝癌；Shank1蛋白

原發性肝癌(PLC)病死率較高，是世界第五大常見的腫瘤，每年全球約有萬余人罹患此病及因此病死亡，其中有90%以上為肝細胞性肝癌(HCC)[1]。我國是肝癌高發區，每年約有38萬人死于肝癌，占全球肝癌病死率的51%。Shank蛋白家族是近年來新發現的一種突觸信號轉導中起重要作用的骨架蛋白，主要包括Shank1、Shank2、Shank3。Shank1具有多種結構域，這些多功能結構域的同時存在使Shank蛋白可在不同的空間結構結合不同的蛋白分子，并介導他們間的相互作用。這使Shank1成為跨越核膜、細胞質及細胞膜的大分子細胞骨架網絡。但Shank家族作為細胞骨架蛋白在腫瘤中的作用研究較少，且均停留于神經疾病領域[2]。我們收集2011年12月～2015年2月75例原發性HCC患者為研究對象，采用免疫組化法、Western blotting技術檢測Shank1蛋白在原發性HCC及癌旁組織中的表達，并分析其表達與HCC患者臨床病理特征的關系，旨在研究Shank1在原發性HCC發生、發展、轉移中的作用，為原發性HCC的分子診斷及基因治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 75例原發性HCC手術后組織標本，經術后病理檢查確診。患者男62例、女13例，年齡34～73歲。淋巴結轉移4例。HBsAg(+)21例，HBsAg(-)54例；合并肝硬化者27例，無肝硬化者48例。術中分別切取癌組織及距腫瘤邊緣至少2 cm的癌旁組織，體積約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。標本在離體2 h內均用中性甲醛進行固定或先用冰盒冷藏再迅速轉移至低溫冰箱保存。

1.2 Shank1蛋白表達檢測 ①免疫組化法：對組織切片進行免疫組織化學染色，實驗步驟：60 ℃烘烤切片2 h，4 μm厚度石蠟切片脫蠟至水；雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中90 ℃微波抗原修復8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；Shank1兔抗人一抗1∶100稀釋后室溫孵育1 h；聚合物增強劑室溫孵育20 min，酶標抗鼠聚合物室溫孵育20 min，常規DAB顯色。以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照組，同時做空白對照。根據陽性、陰性和空白對照的顯色情況，在排除假陽性和假陰性的前提下，計數每例腫瘤組織中的所有腫瘤細胞，當大于10%細胞著色判斷為表達陽性，且以細胞膜或細胞質染成棕黃為弱陽性判定標準，棕褐色為強陽性判定標準。將陰性與弱陽性定義為低表達，強陽性定義為高表達，同時將HCC患者癌組織低表達同時癌旁組織高表達的病例定義為Shank1表達下調病例。②Western blotting法：為進一步證實免疫組化染色結果，選取8例病例樣本對Shank1蛋白表達進行檢測。取新鮮冰凍腎癌組織和癌旁組織按照重量體積比1∶3加入組織裂解液，BCA法測定總蛋白濃度。配置10%分離膠和8%濃縮膠，取50 μg組織總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：32 mA，60 min；轉膜：110 V，120 min，將凝膠上的蛋白濕轉至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h后，抗Shank1(1∶1 000)及抗β-tubulin(1∶20 000)抗體室溫孵育1 h；TBST漂洗后，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h；TBST漂洗后，用電化學發光法檢測。

1.3 Shank1 mRNA表達檢測 選取8例病例樣本采用RT-PCR法檢測Shank1 mRNA表達。TRIzol試劑法提取癌和癌旁組織RNA，經反轉錄獲得cDNA，采用SYBR法經行RT-PCR檢測mRNA水平。兩步法程序如下：預變性95 ℃ 10 s ，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。2-ΔΔCt法分析數據。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以表示，比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Shank1蛋白在肝癌組織及癌旁肝臟組織中的表達比較 免疫組化染色結果顯示Shank1定位于肝細胞胞質及核周，呈棕色顆粒狀，彌漫或灶性分布；肝癌組織及癌旁肝臟組織均能被染色，只是肝癌組織中癌細胞染色為淺棕色，而癌旁肝臟組織肝細胞均著色顏色較深，呈深棕色，提示肝癌組織中Shank1表達量低于癌旁組織。Shank1 蛋白在癌旁肝臟組織中低表達，而在肝癌組織高表達，與免疫組織化學染色的結果一致(P<0.05)。在所收集的75例HCC癌組織和癌旁組織中，癌旁組織Shank1低表達15例，高表達60例；癌組織中Shank1低表達60例，高表達15例。癌旁組織的Shank1高表達率(80%)顯著高于肝癌組織(20%)(P<0.05)，且與癌旁組織相比肝癌組織73.33%(55/75)有不同程度的Shank1基因表達水平下調。

2.2HCC癌組織與癌旁組織中Shank1mRNA表達比較Shank1mRNA在HCC癌組織與癌旁組織中的相對表達量分別為3.08±0.02、0.79±0.03，兩者比較，P<0.05。

2.3Shank1蛋白表達與肝癌臨床病理特征的關系 75例HCC患者癌組織中Shank1表達水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結轉移均無顯著性相關(P均>0.05)，而與臨床分期有關(P<0.05)。Shank1在臨床分期2～4期比1期表達下調顯著(P=0.030 3)，見表1。

表1 Shank1蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系

3 討論

突觸后膜致密物質(PSD)是指位于突觸后膜胞質面的一層均勻而致密的物質，能決定中樞神經系統興奮性突觸的功能[3]。一組新的PSD蛋白，相對分子質量大于200 kD，包含約2 000個氨基酸殘基，作為細胞骨架在突觸后膜中行使重要功能。Shank是一種神經系統中重要的中心骨架蛋白，可連接多種受體、蛋白和細胞骨架，并介導各種受體間的信號傳導，在維持突觸正常功能方面有重要作用[4]。

Shank1在神經組織中表達為完整的Shank蛋白，自N端至C端共有5個結構域，這些完整的結構域使Shank1本身或通過其他骨架蛋白和連接蛋白與多種蛋白分子構成連接，其中有眾多分子與腫瘤的發生、遷移、侵襲等過程相關[5]。如通過富含脯氨酸的結構域與Shank相連的Cortactin[6]。研究顯示，Cortactin在眾多不同來源的腫瘤細胞中均有過量表達，如口腔癌、食管癌、直腸癌、乳腺癌，在肝癌細胞中同樣有過表達現象[7]，且其在多種不同來源的腫瘤中，與腫瘤臨床分期、淋巴轉移、分級等存在相關性[8]。Shank1可與眾多腫瘤相關的基因直接或間接相關，并通過不同方式介導這些分子間的信號傳導、作用調節，但Shank1本身并未作為腫瘤相關分子進行報道，在腫瘤分子機制研究的領域仍是空白。

免疫組化染色結果顯示，Shank1在肝癌細胞和癌旁細胞中均有表達，表達部位集中于細胞質，表達量低的部位表現為淺黃色或淺棕色，表達量高的部位表現為深褐色；基質及腫瘤間質細胞無表達。通過進一步半定量統計發現，HCC癌旁組織病例中有80%被定義為高表達；而在癌組織中僅20%為高表達，顯示Shank1在HCC中的表達水平較癌旁組織中明顯下調，且差異有統計學意義。我們對實驗結果做進一步分析，發現Shank1蛋白表達水平與HCC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結轉移均無顯著性相關，但與臨床分期有顯著相關性，差異有統計學意義。Shank1在臨床分期2～4期比1期表達下調顯著。以上結果均提示Shank1隨腫瘤發展表達量下降。

Shank1蛋白的PDZ結構域可連接骨架蛋白PSD-95，并通過PSD-95與谷氨酸受體NMDA、KAR、mGluR相結合及與細胞黏附分子Semaphorin結合[9]。研究[10]顯示，Semaphorin在HCC中與癌旁和正常組織相比表達下調，且與腫瘤的發展、淋巴結轉移有密切關系。相關研究表明Semaphorins信號通路中包含RhoGTP酶和CRMPs，他們參與調節由Semaphorin引起的細胞骨架改變[11]。Semaphorin3(Sema3)是該家族的分泌型亞家族，在細胞正常發育過程中，Sema3主要調控細胞遷移、黏附，并影響細胞增殖和凋亡，同時參與對神經軸突生長和血管新生控制；病理狀態下，Sema3對腫瘤血管新生及腫瘤生長起重要作用，并在多種腫瘤中發揮抑癌作用[12]。我們推測，Shank1蛋白可能通過Semaphorins等相關蛋白發揮在腫瘤中的抑制作用。

同時，Shank1的富含脯氨酸的結構域通過Homer連接蛋白與mGluRs連接。mGluRs作為一種G蛋白偶聯受體，在外周腫瘤的發生、發展過程中有重要的調節作用。除此之外，Shank1可通過骨架蛋白與RACl/CDC42、AMPA型谷氨酸受體等發生作用，這些分子在諸多類型的腫瘤中均有異常表達[13]。其中RACl/CDC42亦是腫瘤研究中的熱點，在肝癌、肺癌、乳腺癌、腦膠質瘤中均有促進腫瘤生長的作用，且在肝癌細胞中沉默CDC42能起到降低人肝癌細胞種植瘤的增殖、侵襲及遷移能力，抑制腫瘤細胞生長[14]。在應用免疫組化和熒光定量PCR對肝癌組織的檢測中發現，皮層肌動蛋白(CTTN)在癌組織和癌旁組織中存在表達差異，且與腫瘤胞膜完整性，TNM分期、門脈癌栓及肝外轉移方面存在關系[15]。雖然CTTN在肝癌中的具體作用途徑未知，但該研究是肝癌與細胞骨架間關聯的有力證明。

綜上所述，Shank1在HCC組織中表達下調，且Shank1在HCC組織中的表達與患者臨床分期有關；Shank1可能在HCC發生發展中發揮重要作用。

[1] Masaru M, Mototsugu O. Renal cell carcinoma: etiology, incidence and epidemiology[J]. Curr Opin Urol, 2004,14(14):229-233.

[2] Leblond CS, Nava C, Polge A, et al. Meta-analysis of SHANK Mutations in Autism Spectrum Disorders: a gradient of severity in cognitive impairments[J]. PLoS Genet, 2014,10(9):73-82.

[3] Fukunaga Y, Nakajima E, Hatano E, et al. Activation of NMDA receptors thickens the postsynaptic density via proteolysis[J]. Neurosci Res, 2015,101(1):6-14.

[4] Grabrucker S, Jannetti L, Eckert M, et al. Zinc deficiency dysregulates the synaptic ProSAP/Shank scaffold and might contribute to autism spectrum disorders[J]. Brain, 2014,137(Pt 1):137-152.

[5] Gautier R, Fabrice A, Stefano R, et al. Shank expression is sufficient to induce functional dendritic spine synapses in aspiny neurons[J]. J Neurosci, 2005,25(14):3560-3570.

[6] Macgillavry HD, Kerr JM, Kassner J, et al. Shank-cortactin interactions control actin dynamics to maintain flexibility of neuronal spines and synapses[J]. Eur J Neurosci, 2016,43(2):179-193.

[7] He J, Xia T S, Wang S. Cortactin and tumor invasiveness[J]. CJCPT, 2015,22(1)：72-75.

[8] Macgrath SM, Koleske AJ. Cortactin in cell migration and cancer at a glance[J]. J Cell Sci, 2012,125(Pt 7):1621-1626.

[9] Grabrucker AM. A role for synaptic zinc in ProSAP/Shank PSD scaffold malformation in autism spectrum disorders[J]. Dev Neurobiol, 2014,74(2):136-146.

[10] Tomizawa Y, Sekido Y, Kondo M, et al. Inhibition of lung cancer cell growth and induction of apoptosis after reexpression of 3p21.3 candidate tumor suppressor gene SEMA3B[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(24):13954-13959.

[11] Hsieh HH, Chang WT, Yu L, et al. Control of axon-axon attraction by Semaphorin reverse signaling[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014,111(31):11383-11388.

[12] Mckenna CC, Ojeda AF, Spurlin J 3rd, et al. Sema3A maintains corneal avascularity during development by inhibiting Vegf induced angioblast migration[J]. Dev Biol, 2014,391(2):241-250.

[13] Roemeling CAV, Radisky DC, Marlow LA, et al. Neuronal Pentraxin 2 is a regulator of clear cell renal cell carcinoma malignancy through activation of the AMPA-selective glutamate receptor 4[J]. Cancer Res, 2014,74(17):22-26.

[14] Imran Q M, Amna P, Muhammad A. Cdc42: Role in Cancer Management[J]. Chemical Biology & Drug Design, 2015,86(4):432-439.

[15] 周家名,陳莉,葉蘊瑤,等.不同轉移潛能的肝細胞肝癌細胞中EMS1/cortactin的表達與定位[J].南通大學學報(醫學版),2012,32(4):255-257.

劉巖(E-mail:1647120274@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.024

R735.7

B

1002-266X(2016)41-0071-03

2016-06-10)