SFRP1及WiF-1基因啟動子甲基化檢測在結(jié)直腸癌早期篩查中的價(jià)值

銀廣悅，劉創(chuàng)建，周志偉，徐翠玲，錢成榮，武彩虹，田雪梅，汪方圓

(中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院,河北廊坊065000)

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SFRP1及WiF-1基因啟動子甲基化檢測在結(jié)直腸癌早期篩查中的價(jià)值

銀廣悅，劉創(chuàng)建，周志偉，徐翠玲，錢成榮，武彩虹，田雪梅，汪方圓

(中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院,河北廊坊065000)

目的 探討糞便中Wnt途徑的抑制因子(WIF-1)與分泌型卷曲蛋白(SFRP1)基因啟動子甲基化檢測在結(jié)直腸癌(CRC)早期篩查中的價(jià)值。方法 選取32例查體健康者(對照組)與50例CRC患者(CRC組)、30例大腸增生性息肉患者(增生組)、36例大腸腺瘤患者(腺瘤組)為研究對象。采用QIAamp型糞便DNA提取試劑盒對糞便中的DNA進(jìn)行提取，分析比較四組糞便中WIF-1及SFRP1基因甲基化情況。結(jié)果CRC組WIF-1及SFRP1基因甲基化率為60.0%及64.0%，增生組為20.0%及20.0%，腺瘤組為44.4%及52.8%。聯(lián)合WIF-1及SFRP1檢測大腸腺瘤及CRC的敏感度分別為66.7%及76.0%，且兩個(gè)基因在腺瘤組及CRC組中的甲基化水平高于對照組及增生組(P均<0.05)。WIF-1與SERP1基因甲基化和CRC患者臨床病理特征無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸癌患者糞便中SFRP1及WIF-1基因啟動子甲基化率明顯升高，檢測二者水平有助于結(jié)直腸癌早期篩查。

結(jié)直腸癌；腸息肉；大腸腺瘤；Wnt途徑抑制因子1；分泌型卷曲蛋白；甲基化；糞便

結(jié)直腸癌(CRC)為臨床常見的胃腸道惡性腫瘤[1]，臨床常采取仿真結(jié)腸鏡檢查、電子結(jié)腸鏡、糞便潛血實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行CRC的篩選，但此三種方法對腸道準(zhǔn)備的要求嚴(yán)格、特異性低且敏感性差，對早期CRC診斷率不高，患者的依從性較差[2，3]。表觀遺傳調(diào)控為可遺傳基因功能的調(diào)控，而表觀遺傳修飾的重要方式為DNA的異常甲基化改變[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，早期CRC組織中普遍有SFRP基因啟動子甲基化現(xiàn)象。分泌型卷曲蛋白(SFRPs)是一類分泌型糖蛋白,目前發(fā)現(xiàn)SFRPs家族有7個(gè)成員,他們通過結(jié)構(gòu)上有同源性的CRD與Wnt信號的特異性受體Fz受體競爭結(jié)合，是Wnt信號調(diào)節(jié)因子,異常表達(dá)會干擾 Wnt-frizzled信號傳導(dǎo)通路。Wnt途徑的抑制因子(WIF-1)是一種分泌蛋白，主要通過與Wnt蛋白結(jié)合抑制Wnt信號通路。2014年1～12月，我們檢測了大腸良性病變及CRC患者糞便標(biāo)本中WIF-1與SFRP1基因啟動子甲基化情況，探討其在CRC早期篩查中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 CRC患者50例(CRC組)，男25例、女25例，年齡20～87歲，平均62.3歲?；颊呔?jīng)病理檢查確診, Duke分期A～B期30例，C～D期20例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；病變位于左半結(jié)腸33例。患者術(shù)前均未接受放化療治療；糞便收集的前5 d內(nèi)患者未接受灌腸或結(jié)腸鏡檢查等大腸侵入性操作；無家族性的大腸息肉及CRC病史。選取同期30例大腸增生性息肉患者(增生組)，均經(jīng)結(jié)腸鏡檢查確診,男16例、女14例，年齡29～81歲，平均59.1歲。選取同期36例大腸腺瘤患者(腺瘤組)，均經(jīng)結(jié)腸鏡和病理檢查確診,男23例、女13例，年齡27～78歲，平均57.1歲。非進(jìn)展期21例，進(jìn)展期15例。同時(shí)選取32例年齡、性別相近的查體健康者為對照組。

1.2 糞便標(biāo)本中WIF-1與SFRP1基因啟動子甲基化檢測 采集四組研究對象新鮮糞便標(biāo)本，CRC組于術(shù)前未接收化療前采集，并于-80 ℃條件下保存待檢。后取200 mg的糞便標(biāo)本，采用德國Qiagen公司生產(chǎn)的QIAamp型糞便DNA提取試劑盒對糞便中的DNA進(jìn)行提取。采用上海生工生物工程公司制造合成的引物序列。取雙蒸水9 μL、PCR Mix 12 μL、模板2 μL及上下游引物各1 μL作為25 μL的PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)條件：94 ℃、3 min，后于94、62及72 ℃各保持30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，在72 ℃使其延伸達(dá)7 min。在3%瓊脂糖凝膠中對5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并觀察、保存凝膠成像，同時(shí)對DNA亞硫酸氫鈉的純化回收及修飾進(jìn)行改進(jìn)，采用各種基因的非甲基化、甲基化引物對修飾后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。采用上海生工生物工程公司制造合成的引物序列。取Taq酶1 U、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、1.5 mmol/L的Mg2+2 μL、各濃度為5 μmol/L的上游及下游引物1 μL及模板DNA2 μL作為25 μL的PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：保持在95 ℃達(dá)5 min，后在95 ℃及各基因退火溫度與72 ℃的溫度下各保持45 s，總計(jì)38個(gè)循環(huán)，后保持在72 ℃使其延伸達(dá)8 min。在3%瓊脂糖凝膠中對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并用溴化乙錠對產(chǎn)物進(jìn)行染色處理、檢測，用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行拍照、分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較行χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組糞便中WIF-1及SFRP1基因啟動子的甲基化程度比較 聯(lián)合WIF-1及SFRP1檢測大腸腺瘤及CRC的敏感度分別為66.7%及76.0%。見表1。

表1 各組糞便中WIF-1及SFRP1基因啟動子甲基化情況比較[例(%)]

2.2 聯(lián)合WIF-1及SFRP1基因甲基化檢測對腺瘤的診斷價(jià)值 腺瘤組WIF-1及SFRP1基因甲基化的陽性率為44.4%與52.8%，且進(jìn)展期明顯高于非進(jìn)展期。增生組及進(jìn)展期腺瘤組WIF-1及SFRP1基因甲基化陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，增生組與非進(jìn)展期腺瘤組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合WIF-1與SFRP1基因甲基化法對進(jìn)展期腺瘤組與CRC組檢測陽性率為86.7%與76.0%。

2.3 糞便中WIF-1及SFRP1基因甲基化與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系 糞便中WIF-1、SFRP1基因甲基化與CRC患者的年齡、性別、Duke分期、腫瘤部位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。

3 討論

CRC的產(chǎn)生與發(fā)展過程為漸進(jìn)多步驟演變過程，受多種因素的影響，與異常的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制及遺傳性改變有密切聯(lián)系[6]。產(chǎn)生腫瘤的主要機(jī)制之一是腫瘤抑制基因的沉默[7]。正常機(jī)體每4 d更新1次腸黏膜，老化的大腸上皮細(xì)胞不斷脫落至腸腔中最終混于大便中被排出體外[8]。大腸惡性腫瘤細(xì)胞的脫落頻率遠(yuǎn)大于正常大腸細(xì)胞，為其4～5倍，加之其較差的黏附力及其極快的更新速度使得其糞便中易檢出有關(guān)CRC的分子標(biāo)志物[9]。糞便異?；虻募谆瘜Y(jié)直腸癌的早期篩查有重要意義。

目前為止已發(fā)現(xiàn)WIF-1與腫瘤的關(guān)系:WIF-1直接與Wnt蛋白結(jié)合抑制Wnt信號通路，抑制腫瘤的發(fā)生;WIF-1啟動子的高度甲基化導(dǎo)致其在腫瘤中沉默表達(dá);染色體12q14.3上WIF-1基因的雜合性缺失抑制WIF-1 mRNA表達(dá)。Wnt途徑作為調(diào)控腫瘤形成的異常途徑之一，同時(shí)亦在細(xì)胞的分化與增殖方面發(fā)揮重要作用[10]。此途徑的異常激活可抑制細(xì)胞凋亡并使腫瘤細(xì)胞大量增殖，可引起包括白血病、膀胱癌、乳腺癌及頭部腫瘤等各種人體腫瘤，CRC最為多見[11]。WIF-1及SFRP家族為Wnt途徑的第Ⅰ類細(xì)胞外拮抗物質(zhì)，可根據(jù)不同的機(jī)制和Frizzled受體結(jié)合為無作用復(fù)合體或與Wnt直接進(jìn)行反應(yīng)，最終抑制Wnt途徑[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC、增生性息肉及腺瘤患者糞便中WIF-1基因中的啟動子甲基化陽性率分別為60.0%、20.0%及44.4%，SFRP1基因中的啟動子甲基化陽性率則為64.0%、20.0%及52.8%。WIF-1與SFRP1基因的甲基化隨著大腸黏膜病情的惡化越發(fā)明顯，表明其很可能為大腸黏膜逐步惡化的基礎(chǔ)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，WIF-1基因及SFRP家族在CRC早期有高頻的甲基化現(xiàn)象。

據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示，約6%的腺瘤患者轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔┗颊遊14]。本研究結(jié)果顯示，進(jìn)展期的腺瘤患者糞便中WIF-1及SFRP1基因甲基化現(xiàn)象明顯大于非進(jìn)展期腺瘤患者。非進(jìn)展期腺瘤聯(lián)合WIF-1與SFRP1的基因甲基化頻率是52.4%，遠(yuǎn)低于進(jìn)展期腺瘤的頻率(86.7%)，表明進(jìn)展期腺瘤的惡化趨勢。說明WIF-1與SFRP1基因甲基化為CRC早期的頻繁事件，并隨著腺瘤的惡化而逐級遞增，聯(lián)合兩者可較為有效地檢測出進(jìn)展期腺瘤。

本試驗(yàn)中對照組WIF-1及SFRP1基因的異常甲基化現(xiàn)象分別出現(xiàn)2及1例，推斷WIF-1及SFRP1基因的異常甲基化易在癌前隱窩病灶內(nèi)出現(xiàn)，加之其較小的病變使得我們并未在內(nèi)鏡下檢出[15]。由此可見，糞便中出現(xiàn)WIF-1及SFRP1基因的異常甲基化現(xiàn)象患者為CRC高危人群，應(yīng)對其進(jìn)行長期隨訪調(diào)查。本試驗(yàn)結(jié)果并未體現(xiàn)大腸腫瘤的病理表現(xiàn)與患者糞便中的基因甲基化的狀態(tài)有明顯聯(lián)系，說明標(biāo)記物對于大腸的各個(gè)部位有相同的檢測效率。根據(jù)近年來的臨床數(shù)據(jù)顯示，右半結(jié)腸部位的腫瘤的發(fā)病率明顯升高，同樣WIF-1及SFRP1基因啟動子甲基化檢測可大大降低其發(fā)生率。因此SFRP1及WIF-1基因的甲基化檢測在CRC早期篩查中有重要價(jià)值。

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2016-06-01)