RRM1對膽道系統惡性腫瘤患者術后輔助化療療效的預測價值

韓月婷，鄧婷，潘虹，劉銳，王霞，巴一

(1天津醫科大學腫瘤醫院·國家腫瘤臨床醫學研究中心·天津市“腫瘤防治”重點實驗室·天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060；2中國醫學科學院北京協和醫學院血液學研究所)

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RRM1對膽道系統惡性腫瘤患者術后輔助化療療效的預測價值

韓月婷1，鄧婷1，潘虹2，劉銳1，王霞1，巴一1

(1天津醫科大學腫瘤醫院·國家腫瘤臨床醫學研究中心·天津市“腫瘤防治”重點實驗室·天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060；2中國醫學科學院北京協和醫學院血液學研究所)

目的 探討膽道系統惡性腫瘤(BTC)組織中核苷酸還原酶M1(RRM1)表達對術后輔助化療療效的預測價值。方法 采集164例接受手術治療的臨床分期Ⅰ～Ⅲ期BTC患者標本，其中接受吉西他濱術后輔助化療4周期以上者86例(化療組)，未化療者78例(未化療組)。采用免疫組化法檢測腫瘤組織中RRM1表達，Kaplan-Meier 生存曲線分析比較兩組患者的中位生存時間。結果 免疫組化結果顯示，164例樣本中RRM1高表達率43.3%；低表達率56.7%。膽囊癌、膽管癌、壺腹癌患者RRM1表達情況差異無統計學意義(P均>0.05)，RRM1表達與BTC患者各臨床病理特征無統計學相關性(P均>0.05)。未化療組中，RRM1高表達者的總生存期(OS)高于低表達者(P<0.05)；化療組中，RRM1高表達者OS低于低表達者(P<0.001)。結論 在BTC術后未化療患者中，RRM1高表達提示預后較好；而在接受吉西他濱輔助化療患者中，RRM1低表達者更能從術后吉西他濱化療中受益。

膽道系統惡性腫瘤；核苷酸還原酶M1亞基；吉西他濱；術后輔助化療

膽道系統惡性腫瘤(BTC)是一種臨床相對少見的消化系統腫瘤[1]，預后極差，5年生存率僅2%～5%[2，3]。近年來隨臨床檢查方法的進步，越來越多的BTC患者在早期即被確診，若能達到根治性切除并輔以有效術后放化療，生存期能明顯延長。BTC術后輔助化療目前尚無標準方案，研究[4，5]發現，輔助化療對于行根治性手術的BTC患者可延長復發時間，具有一定生存優勢。由于吉西他濱(GEM)毒性較低且臨床應用方便，因此是BTC術后輔助化療最常用的藥物之一。核糖核苷酸還原酶M1亞基(RRMl)可作為GEM耐藥的一個重要預測指標，指導臨床制定個體化的化療方案，這一結論在晚期非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、卵巢癌和白血病等疾病中得到證實[6～8]。目前關于RRM1表達與BTC中GEM化療敏感性相關性研究仍較少。本研究通過臨床資料搜集和免疫組化實驗，比較RRM1在BTC中的表達水平，探討RRM1表達與BTC患者GEM術后輔助化療預后的關系，以期為GEM為基礎的化療方案提供潛在分子預測標志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取天津醫科大學附屬腫瘤醫院2006年1月～2014年1月接受手術治療的膽囊癌、膽管癌和壺腹癌患者164例，男97例、女67例，年齡35～87歲，平均60歲。病理類型為腺癌148例，鱗狀細胞癌9例，肉瘤樣癌5例，印戒細胞癌2例；組織學分化程度：高分化22例，中分化65例，低分化77例。腫瘤病理分期參考美國癌癥聯合會TNM分期系統，164例患者中Ⅰ期35例，Ⅱ期52例，Ⅲ期77例。原發灶部位：膽囊癌70例，膽管癌68例，壺腹癌26例。術后未接受化療者78例；術后1～2個月內接受以GEM單藥，或以GEM為基礎聯合化療方案化療連續4周期以上者86例。

1.2 BTC組織中RRM1表達檢測 采用核糖核苷酸還原酶亞基1(RRMl) 兔單克隆抗體(Abcam，美國)進行免疫組化實驗。方法：選取入組患者腫瘤蠟塊標本，自動切片機切片，控制切片厚度為4 μm，60 ℃恒溫干燥。常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2阻斷滅活內源性過氧化物酶，PBS沖洗，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)微波爐中高檔修復3 min，自然冷至室溫，PBS沖洗，封閉血清工作液封閉，37 ℃、10 min，棄去不洗，滴加一抗4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗，滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，DAB染色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。

1.3 免疫組化結果判斷 參照文獻[9]方法，采用二級評分法進行。用陽性強度評分乘以陽性腫瘤細胞比例評分得到最后的半定量值來衡量最終的蛋白表達強度。總分<5分為低表達，≥5分為高表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。組間率的比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗；生存時間按月計算，以手術日期至死亡或末次隨訪所獲得的截尾時間為準，應用Kaplan-Meier法進行生存數據分析并繪制生存曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BTC組織中RRM1表達及其與臨床病理特征的關系 免疫組化結果示RRM1主要表達于腫瘤細胞胞質中，呈棕黃色染色。164例樣本中低表達93例(56.7%)，高表達71例(43.3%)。70例膽囊癌樣本中低表達37例(52.9%)，高表達33例(47.1%)；68例膽管癌樣本低表達43例(63.2%)，高表達30例(44.1%)；26例壺腹癌低表達13例(50.0%)，高表達13例(50.0%)。膽囊癌、膽管癌、壺腹癌患者RRM1表達情況比較差異無統計學意義(χ2=2.079，P=0.354)。

RRM1在BTC原發灶中的表達與患者性別、年齡、原發灶部位、肝轉移、術前CA19-9水平、病理類型、組織分化程度、神經血管浸潤、T分期、N分期及TNM分期等臨床病理特征無關(P均>0.05)。見表1。

2.2 RRM1表達水平與患者預后的關系 78例未化療患者中RRM1低表達44例(56.4%)，高表達34例(43.6%)。未化療患者中RRM1高表達與低表達者的無病生存期(DFS)差異無統計學意義(14.5個月vs 11.5個月，P=0.078)；RRM1高表達者與低表達者總生存期(OS)差異有統計學意義(20個月vs 16個月，P=0.047)。86例化療患者中RRM1低表達者44例(51.2%)，高表達者42例(48.8%)。生存分析顯示化療患者RRM1低表達者預后優于高表達者，低表達者的DFS和OS均長于高表達者，差異有統計學意義(DFS 35個月 vs 10個月，P<0.001; OS 56個月 vs 12.5個月，P<0.001)。

2.3 RRM1表達水平與患者化療效果的關系 88例RRM1低表達者中44例接受GEM術后輔助化療，44例未接受化療，其DFS分別為35.0個月和11.5個月，OS分別為42.5個月和16.0個月，二者DFS、OS比較，P均<0.001。76例RRM1高表達者中42例接受GEM術后輔助化療，未接受化療34例，其DFS分別為10.0個月和14.5個月(P=0.067)，OS分別為16.5個月和20個月(P=0.099)。RRM1高表達者接受GEM化療后未見明顯獲益。

表1 RRM1表達與BTC患者臨床病理特征的關系

3 討論

BTC是起源于膽囊和膽管上皮的惡性腫瘤，多數為腺癌，惡性程度甚高，目前手術是惟一的根治手段。雖然手術切除率不斷提高，由于BTC的特殊生物學特性，大部分患者術后易出現復發或轉移，術后3年生存率僅約22%[10]。幾項針對局部晚期或遠處轉移BTC的隨機對照試驗表明，不可切除BTC患者可從化療中生存獲益，英國Ⅲ期臨床試驗ABC-02首次確立了GEM聯合奧沙利鉑為晚期BTC的標準化療方案[11]。Neoptolemos等[12]研究發現，GEM對R0患者有生存獲益的趨勢，可作為BTC術后輔助化療的臨床參考。

GEM系胞嘧啶核苷衍生物，屬于細胞周期特異性抗腫瘤藥物，主要殺傷處于DNA合成S期的細胞，同時亦阻斷細胞由G1期向S期轉化的進程。GEM在細胞內要經過兩步磷酸化反應生成GEM二磷酸核苷(dFdCDP)、GEM三磷酸核苷(dFdCTP)，dFdCTP競爭性結合到DNA中，抑制DNA鏈的延長，導致DNA復制提前終止。同時dFdCDP還可抑制核苷酸還原酶的活性，使細胞內DNA合成與修復所必需的原料脫氧二磷酸核苷減少,從而進一步抑制DNA的合成[13]。核苷酸還原酶(RR)是RNA合成的前體,參與DNA損傷修復。RRM1是RR的亞單位，對DNA的合成和修復起重要作用，目前發現RRM1基因是核苷類似物系的化療藥物結合位點，其高表達相對削弱GEM對RR抑制作用,導致腫瘤細胞對藥物的敏感性下降。RRM1是GEM耐藥的一個重要預測指標[14]。 本研究結果顯示，在BTC組織中RRM1低表達者術后GEM為基礎方案化療中位DFS與OS較未化療者明顯延長，差異有統計學意義；而在RRM1高表達者中，化療與未化療者的中位DFS與OS差異無統計學意義，提示GEM術后輔助化療更有可能在RRM1低表達者的BTC人群中受益，延長生存期，RRM1低表達者對GEM敏感性較高，化療效果明顯優于高表達者。

目前關于RRM1表達水平與惡性腫瘤患者預后關系的研究結論尚未取得一致。RRM1在不同腫瘤、相同腫瘤的不同分期或病理類型中的差別尚不清楚。本研究發現，RRM1表達與腫瘤發病部位、病理類型、組織分化程度及臨床分期等臨床病理特征無統計學相關性。在BTC未化療患者中，RRM1高表達者較低表達者中位OS顯著延長，差異有統計學意義，而DFS雖有延長趨勢，但差異無統計學意義，提示RRM1表達可作為早期BTC術后患者的預后影響因子，而經過多因素分析發現RRM1表達不是BTC術后患者預后的獨立影響因素，從一定程度上說明RRM1表達可作為早期BTC預后的預測指標。RRM1高表達能使機體對理化因素造成的DNA損傷有較強修復能力,早期BTC患者單獨接受手術治療時,RRM1高表達者預后較好；同時RRM1高表達亦導致含GEM化療產生的腫瘤細胞DNA損傷修復能力增強,其結果表現為耐藥現象,晚期的BTC患者接受GEM化療時,RRM1高表達則預后較差。

綜上所述，對于早期BTC患者來說，RRM1表達在篩選高危與低危、是否易復發、予以何種后續治療有重要意義，可避免不適當的治療；而對于需接受姑息性或輔助化療者，RRM1表達水平可預測化療藥物GEM的療效，從而指導臨床用藥。本研究入選的BTC患者總例數雖達到164例，但局限于單中心研究，且各小組的樣本數均不夠大，目前研究所獲得的結果僅是一種趨勢。最終明確RRM1表達與BTC預后與化療受益的關系，仍需通過大樣本的多中心前瞻性Ⅲ期臨床試驗進一步分層分析。

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巴一(E-mail：dryiba@gmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.014

R735.8

B

1002-266X(2016)41-0046-03

2016-07-21)