特異性信號轉導阻滯劑AG490對人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的影響及機制

趙冀安，趙洪正，周小慧，孫會鳳，朱俊青，胡毅平

(河北醫科大學第一醫院，石家莊050013)

?

特異性信號轉導阻滯劑AG490對人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的影響及機制

趙冀安，趙洪正，周小慧，孫會鳳，朱俊青，胡毅平

(河北醫科大學第一醫院，石家莊050013)

目的 探討特異性信號轉導阻滯劑AG490對人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制。方法 將培養好的人肝癌細胞株HepG2用4、6、8 mg/kg的AG490(AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組)進行處理，另設對照組(僅加PBS)。AG490干預24 h，MTT法測算細胞增殖抑制率；流式細胞術測算細胞周期及凋亡率；采用Hoechst 33342染色法觀察細胞形態學變化；采用Western blotting法檢測HepG2細胞中P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表達。結果 AG490干預24 h，與對照組比較，AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組細胞增殖抑制率、G0/G1期細胞比例、細胞凋亡率逐漸升高(P均<0.05)，且呈濃度依賴性(P均<0.05)；HepG2細胞核染色質固縮濃集、碎裂，凋亡小體形成，藍色熒光增強，且AG490濃度越高以上變化越明顯；P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2、Survivin蛋白表達降低，而Bax、Caspase-3蛋白表達升高(P均<0.05)。結論 AG490可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路表達抑制人肝癌HepG2細胞增殖并促進其凋亡。

肝腫瘤；HepG2細胞；Janus激酶2/信號轉導子與轉錄激活子3信號通路；信號轉導阻滯劑AG490

肝癌的發生發展是多基因突變演化進展的過程，發病機制目前仍不明確。Janus激酶2/信號轉導子與轉錄激活子3(JAK2/STAT3)信號通路在細胞增殖、凋亡、分化和免疫功能等過程中發揮重要作用，當該信號通路發生異常活化時會導致細胞出現異常增殖甚至惡變[1]。STAT3作為JAK2/STAT3轉導通路的重要成員，可與相關轉錄因子相互作用，使JAK2/STAT3與其他信號通路相互關聯，在腫瘤發生發展中起重要作用[2，3]。研究證實，多種肝癌細胞內均有STAT3激活，JAK2/STAT3信號通路活化顯著促進了肝癌細胞增殖[4]。STAT3調控的靶基因編碼蛋白包括抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1、存活蛋白Survivin、促凋亡蛋白Bax及血管內皮生長因子(VEGF)[5]。JAK2/STAT3信號通路的特異性信號轉導阻滯劑AG490可影響肝癌細胞的多種生物學特性(抑制肝癌細胞增殖和誘導凋亡，降低侵襲力等)[6]。2015年8～12月，我們探討了AG490對人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2(河北醫科大學腫瘤研究所)，AG490、MTT(Sigma公司)，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Hoechst 33342(BioVision公司)，P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3和β-actin兔抗人多克隆抗體(Santa公司)。

1.2 細胞培養及分組 將人肝癌細胞株HepG2用含10% FBS的RPMI1640培養基培養，置于5% CO2、37 ℃孵箱中傳代培育。取對數生長期的HepG2細胞，接種于96孔培養板(含10% FBS的RPMI1640培養液稀釋后的懸液)，貼壁孵育24 h分別加入不同濃度(4、6、8 mg/kg)的AG490溶液0.2 mL，根據AG490濃度將細胞分為AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組，另設對照組,不加藥物，僅加PBS。

1.3 細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。分別用AG490干預8、12、24 h取各組細胞，每孔各加入DMSO溶液100 μL，振蕩5 min，用酶標儀測定490 nm波長的吸光度(A)值。每個實驗組設3個復孔。計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=[(實驗組A-對照組A)/對照組A]×100%。

1.4 細胞周期及凋亡率測算 采用流式細胞術。AG490干預24 h取各組細胞，PBS清洗2次，棄上清液，用PBS洗滌后懸浮，加入Annexin V 5 μL、PI 5 μL，混勻，4 ℃避光反應30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。

1.5 細胞形態學變化觀察 采用Hoechst 33342染色法。AG490干預24 h取各組細胞，吸棄上清液，PBS清洗，每孔加入固定液100 μL，固定10 min。去除固定液，PBS洗2次，滴加Hoechst 33342工作液100 μL，室溫染色10 min。以340 nm波長紫外光激發，熒光顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

1.6 HepG2細胞中STAT3及下游相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法。AG490干預24 h取各組細胞，去除培養液，PBS洗1次，刮下細胞提取蛋白并定量，取等量蛋白電泳分離，轉移到PVDF膜，轉移膜用1% BSA封閉。隨后加入1∶1 000的兔抗人P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3和β-actin多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，用TBST洗3次后再分別加入1∶5 000標記的抗兔二抗，室溫下孵育1 h，TBS洗3次。經ECL化學發光法檢測并記錄各目的條帶與內參條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度比值作為各目的蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1AG490對HepG2細胞增殖的影響AG490對HepG2細胞增殖抑制作用呈濃度和時間依賴性，各組不同時間細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖抑制率比較

2.2 AG490對HepG2細胞周期和凋亡率的影響 對照組、AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組G0～G1期細胞百分比分別為(59.48±1.1)%、(64.59±2.6)%、(69.55±3.4)%、(73.28±3.9)%；與對照組比較，AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組G0～G1期細胞逐漸增多(P均<0.05)，且呈濃度依賴性(P均<0.05)。對照組、AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組細胞凋亡率分別為(1.50±0.12)%、(33.32±1.16)%、(45.54±1.22)%、(52.22±1.06)%；與對照組比較，AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組細胞凋亡率逐漸升高(P均<0.05)，且呈濃度依賴性(P均<0.05)。

2.3 細胞形態學變化 對照組細胞核在熒光顯微鏡下顯示為較弱的均勻藍色熒光，可見細胞核完整且染色均勻。AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組則可見凋亡細胞呈致密濃染，核染色質固縮濃集、碎裂，凋亡小體形成，藍色熒光增強，且AG490濃度越高以上變化越明顯。2.4 AG490對HepG2細胞STAT3及下游相關蛋白表達的影響 與對照組比較，AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組P-STAT3、P-JAK2、Bcl-2蛋白表達降低，Bax、Caspase-3蛋白表達升高(P均<0.05)，且呈濃度依賴性(P均<0.05)。見表2。

表2 各組STAT3及下游相關蛋白相對表達量比較

3 討論

肝癌的發生發展有眾多信號通路參與[7]。JAK2/STAT3信號通路廣泛參與體內多種重要生長因子信號轉導，參與調節正常細胞的增殖、分化、凋亡、免疫應答等過程[8,9]。STAT3可通過上調Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Survivin等抗凋亡基因的表達抑制細胞凋亡；同時抑制基因p53和Bax表達，抑制正常細胞分化增殖和腫瘤細胞凋亡，最終導致肝癌發生[10]。AG490作為酪氨酸激酶抑制劑通過阻斷JAK2激酶活化，使細胞中STAT3表達降低，從而發揮阻滯細胞信號傳導作用。

Yoshikawa等[11]發現，AG490通過細胞信號抑制因子與JAK2的關聯抑制STAT3的激活，從而使肝癌細胞貼壁生長受到抑制，同時促進細胞凋亡。AG490通過抑制STAT3與DNA結合的活性以抑制STAT3活化與凋亡，從而誘導骨髓瘤細胞U266凋亡，證明AG490有抗腫瘤作用[12]。梁斌等[13]實驗用AG490阻斷JAK2/STAT3信號通路后，人胃癌細胞的增殖受抑，且基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9表達下降，MMP-2、MMP-9抑制劑TIMP-1、TIMP-2表達上調。

本研究結果顯示，不同濃度的AG490均可使HepG2細胞生長受到抑制，同時誘導細胞發生凋亡，并且呈濃度和時間依賴性。AG490 4 mg/kg組、AG490 6 mg/kg組、AG490 8 mg/kg組P-JAK2、P-STAT3及下游抗凋亡蛋白(Bcl-2、Survivin)表達明顯減弱，而Bax和Caspase-3蛋白表達升高，與對照組比較差異有統計學意義。認為AG490通過與受體酪氨酸激酶競爭結合抑制JAK2磷酸化，使STAT3不能被JAK2磷酸化后再二聚化，有效阻斷STAT3活化，使凋亡相關蛋白表達受到影響，從而抑制腫瘤細胞的生長并促進凋亡。

綜上所述，AG490通過阻斷JAK2/STAT3信號通路的表達抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。

[1] Levy DE, Darnell JE. Stats: transcriptional control and biological impact[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002,3(9):651-662.

[2] Booz GW, Day JN, Baker KM. Interplay between the cardiac rennin angiotensin system and JAK-STAT signaling: role in cardiac hypertrophy, ischemia/reperfusion dysfunction, and heart failure[J]. J Mol Cell Cardiol, 2002,34(11):1443-1453.

[3] Wung BS , Hsu MC, Wu CC, et al. Resveratrol suppresses IL-6-induced ICAM-1 gene expression in endothelial cells: effects on the inhibition of STAT3 phosphorylation[J]. Life Sci, 2005,78(4):389-397.

[4] Mueller KM, Kornfeld JW, Friedbichler K, et al. Impairment of hepatic growth hormone and glucocorticoid receptor signaling causes steatosis and hepatocellular carcinoma in mice[J]. Hepatology, 2011,54(4):1398-1409.

[5] 龔代鵬，張竹青，張妍，等.p-STAT3、Survivin和Mcl-1蛋白在胃癌組織中的表達及意義[J].中華臨床醫師雜志,2015,9(6): 915-920.

[6] 劉波，王洪林，宋立文.Janus激酶抑制劑AG490對人肝癌SMMC-7721細胞侵襲轉移的影響[J].第三軍醫大學學報,2011,33(18):1960-1963.

[7] Brivanlou AH, Darnell JE Jr. Signal transduction and the control of gene expression[J]. Science, 2002,295(5556):813-818.

[8] Kim MS, Lee WS, Jeong J, et al. Induction of metastatic potential by TrkB via activation of IL6/JAK2/STAT3 and PI3K/AKT signaling in breast cancer[J]. Oncotarget, 2015,6(37):40158-40171.

[9] Li L, Li H, Li M. Curcumin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by activating JAK2/STAT3 signaling pathway in rats[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(9):14985-14991.

[10] Hsieh FC, Cheng G, Lin J. Evaluation of potential Stat3-regulated genes in human breast cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,335(2):292-299.

[11] Yoshikawa H, Matsubara K, Qian GS, et al. SOCS-1, a negative regulator of the JAK/STAT pathway, is silenced by methylation in human hepatocellular carcinoma and shows growth-suppression activity[J]. Nat Genet, 2001,28(1):29-35.

[12] Catlett-Falcone R, Landowski TH, Oshiro MM, et al. Constitutive activation of Stat3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells[J]. Immunity, 1999,10(1):105-115.

[13] 梁斌,王杉,葉穎江,等.JAK2激酶抑制劑AG490對胃癌細胞侵襲的影響[J].中華普通外科雜志,2004,19(10):627-630．

河北省醫學科學研究重點課題(20150634)。

胡毅平(E-mail:171955999@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.011

R735.7

A

1002-266X(2016)41-0038-03

2016-05-30)