肝癌組織中父系表達基因10的表達變化

常林，楊瑞麗，陳紅兵，陽艷麗

(1南京醫科大學附屬南京兒童醫院,南京210009；2東南大學)

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·基礎研究·

肝癌組織中父系表達基因10的表達變化

常林1，楊瑞麗2，陳紅兵1，陽艷麗1

(1南京醫科大學附屬南京兒童醫院,南京210009；2東南大學)

目的 觀察不同肝癌細胞系、肝癌和鄰近癌旁組織及不同分化程度的肝癌組織中印記基因父系表達基因10(PEG10)的表達。方法 應用本實驗室制備的高特異性抗PEG10單克隆抗體，采用Westernblotting法檢測肝癌細胞系MHCC97L、HepG2、BEL-7404、HepG2.215、SMMC-7721細胞及正常肝細胞系L02、卵巢癌細胞系HO8910、食管癌細胞系EC9706中PEG10表達；采用免疫組化法檢測不同分化程度肝癌組織、癌旁組織中PEG10表達。肝癌分化程度與PEG10表達間的關系采用Spearman相關性分析。結果 五株肝癌細胞系均較強表達PEG10蛋白，而正常肝細胞系L02和卵巢癌細胞系HO8910、食管癌細胞系EC9706均不表達PEG10蛋白。免疫組化實驗結果顯示，同一病例的肝癌組織高表達PEG10蛋白，而相應的鄰近癌旁組織低表達或不表達PEG10蛋白。相關分析顯示，肝癌分化程度與PEG10蛋白表達呈正相關(r=0.822，P<0.05)。結論PEG10在肝癌組織及肝癌細胞系中呈高表達，而在正常肝組織、肝細胞中及其他器官的腫瘤細胞株中均不表達；PEG10表達與肝癌分化程度呈正相關關系。

肝腫瘤；印記基因父系表達基因10；單克隆抗體

父系表達基因10(PEG10)是2001年Ryuichi等[1]在肝細胞癌組織中發現的一個新的遺傳印記基因，是一個反轉座子衍生來的父系遺傳印記基因。本課題組已于早前制備出高特異性的抗PEG10抗體兩株[2]。研究表明，PEG10基因的高表達與腫瘤特別是肝癌發生關系密切[3]。目前，關于PEG10基因與原發性肝細胞癌(HCC)相關性的研究較少，Okabe等[4]于2003年發現PEG10基因在絕大多數人肝癌組織及肝癌細胞系中高表達,癌旁組織表達水平很低或不表達；從病變前癌旁肝組織到病變早期HCC組織再到晚期HCC組織,其PEG10基因表達呈明顯上升趨勢。隨后，有研究顯示，PEG10基因在正常肝組織及良性肝臟疾病組織中均不表達，而在肝癌中表達增強[5]。2007～2010年，我們觀察了不同肝癌細胞系、肝癌和鄰近癌旁組織及不同分化程度的肝癌組織中PEG10的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞系MHCC97L、HepG2、BEL-7404、HepG2.215、SMMC-7721細胞；正常肝細胞系L02；卵巢癌細胞系HO8910、食管癌細胞系EC9706。BCA蛋白定量試劑盒購自上海西塘公司；抗a-tubulin單抗，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗小鼠IgG、生物素標記羊抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶(HRP)標記親和素購自Sigma公司；抗PEG10單抗為本實驗室制備(3E8株)；ECL顯色底物(Maximum Sensitivity Substrate)購自上海吉泰生物有限公司；DAB顯色液購自中杉金橋公司；PVDF膜購自南京創瑞公司；X線片購自美國Kodak公司。15對同一病例肝癌及鄰近癌旁組織蠟塊，由南京市鼓樓醫院和南京市第一人民醫院惠贈。病理切片由東南大學病理教研室制作。

1.2 細胞系蛋白樣本制備 用1×PBS懸浮細胞；反復凍融懸浮細胞3～4次；離心，10 000 r/min，10 min，取上清，-20 ℃保存。

1.3 不同肝癌細胞系中PEG10蛋白表達測定 采用Western blotting法。將本實驗室已有的正常肝細胞L02、肝癌細胞系(HepG2、HepG2.215、SMMC-7721、BEL-7404、MHCC-97L)和卵巢癌細胞HO8910、食管癌細胞EC9706復蘇后，用1×PBS懸浮細胞，反復凍融懸浮細胞，離心，提取各細胞系總蛋白。不同細胞系蛋白經BCA蛋白定量試劑盒測定，根據蛋白定量結果調整上樣量，每孔上樣蛋白量為15～20 μg,各樣品加入1/4體積4×SDS樣品加樣緩沖液混勻，每孔最大上樣體積為20 μL。具體操作過程：10%SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBS于4 ℃封閉過夜，TBST洗膜3次(10 min/次)后，加入本實驗室制備的抗PEG10單克隆抗體，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，按1∶5 000加入二抗(熒光標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)后用濾紙吸去多余液體，顯色。

1.4 肝癌組織和鄰近癌旁組織中PEG10蛋白表達檢測 采用免疫組化法。將切片分為肝癌組織、癌旁組織，用本實驗室制備的抗PEG10單克隆抗體進行免疫組化染色以分析PEG10在HCC組織中的表達部位。免疫組化的染色方法參照SABC試劑盒說明書。評分標準采用Carcangin雙計分法：細胞陽性染色強度計分為3分(深棕色)、2分(棕色)、1分(淡棕色)和0分(陰性)；根據陽性細胞數量多少計分為3分(60%以上)、2分(20%～60%)、1分(20%以下)和0分(陰性)。兩種計分相乘的積總分≥4分為高表達，≤3分為低表達或陰性。

1.5 不同分化程度肝癌組織中PEG10蛋白表達檢測 取15例份肝癌組織切片，其中低分化(病理分級為Ⅲ級)7例、中分化(病理分級為Ⅱ級)4例和高分化(病理分級為Ⅰ級)4例，用單克隆抗體3E8進行免疫組化染色。評分標準采用Carcangin雙計分法：細胞陽性染色強度計為3分(深棕色)、2分(棕色)、1分(淡棕色)和0分(陰性)；根據陽性細胞數量多少計為3分(6O%以上)、2分(20%～60%)、1分(20%以下)和0分(陰性)。兩種計分相乘的積總分≥4分為高表達，≤3分為低表達或陰性。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。肝癌分化程度和PEG10表達量間的關系采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同肝癌細胞系中PEG10蛋白表達比較 五株肝癌細胞系中均發現有PEG10表達，見圖1。由圖1可見HepG2細胞系中PEG10蛋白表達量最高，MHCC-97L細胞系中PEG10蛋白表達量最低。而正常肝細胞系L02、食管癌細胞系EC9706和卵巢癌細胞系HO8910中均未檢出PEG10表達。

2.2 肝癌組織和鄰近癌旁組織中PEG10蛋白表達比較 73.3%(11/15)的肝癌組織PEG10高表達，而相應93.3%(14/15)的癌旁組織低表達或不表達。肝癌組織平均分為5.8分，癌旁組織平均分為1.4分。

2.3 不同分化程度肝癌組織中PEG10蛋白表達比較 HCC低分化癌組織中PEG10均呈高表達(7/7)；HCC中分化癌組織中PEG10高表達率為75%(3/4)；HCC高分化癌組織中PEG10高表達率為25%(1/4)。低分化、中分化和高分化肝癌組織中PEG10表達平均分分別為3.2、5.5、8.5分，相關性分析示肝癌分化程度與PEG10表達呈正相關(r=0.822，P<0.05)。

注：1為MHCC-97L細胞裂解液；2為HepG2.215細胞裂解液；3為SMMC-7721細胞裂解液；4為HepG2細胞裂解液；5為BEL-7404細胞裂解液。

3 討論

我國是肝癌高發區，約占全世界肝癌的45%[6]。目前臨床使用的以甲胎蛋白(AFP)為基礎的血清學檢測指標是早期診斷HCC相對準確的方法, 但AFP對肝癌早期診斷有很大局限性，肝癌患者AFP呈陰性或低濃度陽性的原因尚無定論[7]。另外，肝癌的治療方法仍以肝部分切除術和肝移植為主，但由于缺乏與肝癌的分期相結合的“分子分型”信息指導，治療時常出現類似病情的不同患者對相同治療措施卻出現不同的臨床反應，以及難以對患者做出準確的預后判斷，術后復發與轉移率較高。因此，我們迫切需要一種新的肝癌分子標志物，在肝癌的早期診斷、個體化治療及預后判斷等方面發揮作用。

PEG10 是一個父系表達的遺傳印記基因，其在小鼠中的同源基因亦屬于印記。目前研究提示該基因與HCC的發生發展密切相關。從2001年首次報道PEG10基因以來，國內外對PEG10作用于肝癌的報道尚不多。張海等[7]發現PEG10對HCC預后有很好的評估價值，但其特異性高而敏感性不高，需要聯合其他指標作出綜合評價。張美平[8]認為PEG10在絕大多數肝癌中特異性高表達,其致癌作用很可能部分歸因于Wnt/β-catenin信號通路。根據Jia等[9]2007年的報道,用定量PCR綜合分析PEG10基因和其他四個肝癌相關基因在HCC組織中的過表達,能較準確地診斷HCC患者,包括那些血清AFP正常的HCC患者和小肝癌患者。

Okabe等[4]研究發現，PEG10具有高度組織特異性，在多數人肝癌組織及肝癌細胞系中高表達，而在正常肝組織和肝細胞中及其他器官的腫瘤細胞株、胰腺、結腸、胃、淋巴細胞和表皮細胞中均不表達。本實驗為了驗證PEG10的高度組織特異性，亦為了比較各個肝癌細胞系間PEG10表達差異，通過Western blotting法檢測了肝癌細胞系、正常肝細胞系和非肝癌細胞系。結果顯示，正常肝細胞系L02和非肝癌細胞系HO8910和EC9706不表達PEG10，而所選用的五株肝癌細胞系(HepG2、MHCC97L、HepG2.215、BEL-7404、SMMC-7721)均檢測到不同程度的表達，其中HepG2表達最強而MHCC97L表達最弱。以上結果一方面為了確證抗PEG10單抗適合用Western blotting方法檢測PEG10蛋白表達，另一方面亦證實了PEG10在肝癌細胞系中的高度特異性。從臨床應用價值方面看，本實驗制備的抗PEG10單抗能在HepG2、MHCC97L、HepG2.215、BEL-7404、SMMC-7721五種細胞中檢測到PEG10表達，為進一步研究PEG10表達上調對細胞系抗藥性、轉移性、侵襲力等一系列生物學性狀的影響等奠定了基礎，亦為個體化治療研究提供了依據。

近年來，隨著免疫組化技術的發展和各種特異性抗體的出現，免疫組織化學技術在腫瘤診斷中已被廣泛應用，使諸多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規腫瘤病理診斷中，5%～10%的病例單靠HE染色難以作出明確的形態學診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值得到普遍認可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時，準確率可達50%～75%。既然PEG10蛋白很有可能是一種新的肝癌分子標志物，尋找能應用免疫組化染色技術的抗PEG10單克隆抗體尤為重要。本實驗應用制備的單抗PEG10株，采用免疫組化技術檢測15對肝癌、癌旁組織中PEG10表達情況，結果顯示73.3%(11/15)肝癌組織高表達，而只有6.7%(1/15)的癌旁組織高表達，93.3%(14/15)癌旁組織表達很低或不表達PEG10。此與Okabe等[4]實驗結果一致。本實驗結果表明，單抗PEG10株能適用于免疫組化技術來檢測PEG10蛋白表達。根據肝癌分化程度，對上述實驗結果進一步分析時，我們發現HCC低分化癌組織中PEG10均高表達(7/7)；HCC中分化癌組織中PEG10的高表達率為75%(3/4)；HCC高分化癌組織中PEG10高表達率為25%(1/4)。以上結果提示PEG10與HCC的關系更密切，我們可初步認為PEG10高表達與HCC的分化程度存在一定相關性，即HCC的分化程度越低，PEG10表達量越高。其中，第A0902號標本癌旁組織中檢測到PEG10高表達。分析可能原因是癌旁組織中混有表達PEG10的癌組織，因為在肝切除手術中，不能用顯微切割來準確分離癌和癌旁組織。今后仍需進一步擴大樣本量，進一步證明以上的結果判斷。

總之，PEG10具有高度組織特異性，其在肝癌組織及肝癌細胞系中呈高表達，而在正常肝組織和肝細胞中及其他器官的腫瘤細胞株中均不表達；PEG10在不同分化程度的肝癌組織中表達量不同，且惡性程度越高，PEG10表達量越高，提示PEG10表達量與惡性程度具有一定相關性。本研究有助于進一步研究PEG10表達上調對肝癌細胞系生物學性狀的影響；探索PEG10作為肝癌分化程度、臨床分期、大體分型、靶向性治療靶分子及判斷患者預后等可行性提供可靠的工具。僅在肝癌細胞和組織中檢測PEG10的表達，對于提高肝癌的早期診斷顯然不夠。所以，將制備出的抗體初步應用于血清學診斷，擴大臨床樣本，以提高肝癌的早期診斷，特別是提高AFP陰性肝癌的早期診斷還有待進一步研究。

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江蘇省衛生廳課題(H200758)。

楊瑞麗(E-mail：yrl812@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.008

R735.7

A

1002-266X(2016)41-0030-03

2016-05-06)