不同滅菌方法對煙草和擬南芥種子萌發及無菌苗生長的影響

張晶華，馬亞麗，蘭海燕

（1.新疆大學生命科學與技術學院／新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046；2.新疆大學資源與環境科學學院，烏魯木齊 830046；3.新疆教育學院，烏魯木齊 830043）

不同滅菌方法對煙草和擬南芥種子萌發及無菌苗生長的影響

張晶華1，馬亞麗2，3，蘭海燕1

（1.新疆大學生命科學與技術學院／新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046；2.新疆大學資源與環境科學學院，烏魯木齊 830046；3.新疆教育學院，烏魯木齊 830043）

【目的】在植物轉基因研究中及時獲得大量健壯的無菌苗是后續實驗的基礎。研究種子的滅菌處理方法對種子萌發及隨后的幼苗生長的影響。【方法】以煙草和擬南芥種子為材料，通過比較次氯酸鈉（NaClO）滅菌后用無水乙醇或／和滅菌水單獨或交替處理的效果，研究其對擬南芥粘液質種子和煙草無粘液質種子的萌發和無菌幼苗生長的影響。【結果】無水乙醇對煙草種子萌發及幼苗生長有顯著抑制作用，萌發率、幼苗根長和株高等均顯著降低；無水乙醇短時間處理能促進擬南芥萌發、幼苗生長及葉片數的增多，而無水乙醇長時間處理只能促進擬南芥主根的伸長。結合種子萌發和幼苗的生長狀況，10%NaClO處理4 min后用滅菌水潤洗對煙草種子滅菌效果最好；10%NaClO處理4 min后，先無水乙醇潤洗2次，再滅菌水潤洗3次對擬南芥種子滅菌效果最好。【結論】煙草和擬南芥均屬于小種子類型，但二者最佳滅菌方法顯著不同，為兩種轉基因模式植物煙草和擬南芥種子的滅菌方法提供參考依據。

煙草；擬南芥；滅菌方法；種子萌發；幼苗生長

0 引 言

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacum）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為目前轉基因研究的典型模式植物已被廣泛應用［1］。在植物遺傳轉化過程中，獲得長勢良好的無菌苗是實驗成功的前提［2－4］。煙草和擬南芥均屬小種子類型，但前者無粘液質后者有粘液質［5］，其種子滅菌方法有較大差異。在實驗過程中常由于種子滅菌方法不當，造成滅菌不徹底、種子腐爛霉變或培養基污染，從而嚴重影響實驗效果［6］。【前人研究進展】目前對煙草和擬南芥種子的滅菌主要采用 70%或75%乙醇、0.1%升汞、0.1%或 0.5%硫酸銅、5%或10%H2O2、0.1%氯化汞以及不同濃度的次氯酸鈉等溶液漂 洗［1，2，7－11］。然而，煙 草 和 擬 南芥種子滅菌的最后潤洗過程各有不同。煙草種子均采用滅菌水潤洗；擬南芥種子有些采用滅菌水潤洗，有些則用 0.02%的吐溫或 75%乙醇潤洗［12－20］，潤洗產生的結果各不相同，其中75%乙醇潤洗種子萌發率可達 100%［18，19］，顯著高于其他方法。【本研究切入點】實驗對煙草和擬南芥種子采用無水乙醇和10%NaClO滅菌，然后用無水乙醇或／和滅菌水單獨或交替潤洗［1］等各種不同處理，對煙草和擬南芥種子萌發（日萌發率、發芽勢、發芽率和發芽指數）［11，21］及無菌苗生長狀況（活力指數［11］、主根長［2］以及幼苗的株高和葉片數）進行觀察。【擬解決的關鍵問題】研究不同滅菌后處理方法對煙草和擬南芥種子萌發及無菌苗生長的影響，尋求兩種模式植物最佳的種子滅菌與后處理方法的組合，快速獲得生長良好的無菌苗，為后續的高效遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試煙草（W438）和擬南芥（Columbia－0）種子為實驗室2014年繁殖并于 4℃保存。實驗前已對兩種種子進行預萌發以保證使用的種子均有活力，其萌發率分別為96.7%和93.3%。

1.2 方 法

1.2.1 滅菌和潤洗處理

煙草和擬南芥種子先用無水乙醇處理 30 s，再用10%NaClO處理 4 min，然后用滅菌水分別潤洗0次（CK）至5次（表示為：w＋1、w＋2、w＋3、w＋4、w＋5），或用無水乙醇分別潤洗 1次至5次（表示為 e＋1、e＋2、e＋3、e＋4、e＋5）。隨后設計不同潤洗組合處理，具體如下：（1）w＋5；（2）先e＋1后w＋4；（3）先e＋2后w＋3；（4）先e＋3后w＋2；（5）先 e＋4后w＋1；（6）e＋5。之后將處理好的種子放在無菌操作臺中晾干備用。

1.2.2 種子萌發實驗及幼苗生長測定

將種子置于 12 h光照／12 h黑暗，光照強度3 000～5 000 lux，溫度 25～27℃，濕度 40% ～60%的溫室中培養。（1）將煙草和擬南芥種子點在MS培養基（大量元素、微量元素、有機元素、鐵鹽，3%蔗糖和 0.7%瓊脂）的 9cm培養皿里，每皿分四個象限即四個重復，每重復 30粒，用保鮮膜封口，每天觀察記錄種子萌發情況。（2）將煙草和擬南芥種子點在 MS培養基（配方同上）的10cm方皿中垂直培養，每個方皿 13粒，每個處理3個重復，之后用保鮮膜封口，7 d后觀察種子的生根情況并照相。（3）待種子萌發14 d后，將方皿中的幼苗移至含有 MS培養基的廣口瓶中繼續培養，30d后測株高，觀察并記錄葉片數，每個處理測定 10株幼苗。

1.2.3 種子發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數的計算［11，21］

種子萌發以胚芽突破種皮露白長度為種子長度的一半時（如煙草）或胚根伸長至與種子等長（如擬南芥）為標準［2］。

1.2.4 幼苗主根長、株高的測量及葉片數的計算

主根長：隨機選取長勢相似的萌發14 d后的煙草和擬南芥幼苗，每處理 26株，測量主根長。株高和葉片數：隨機選取長勢相似的萌發30d后的煙草和擬南芥幼苗，每處理10株，測量株高，統計葉片數。

1.3 數據統計

對煙草和擬南芥的主根長和株高采用軟件Image J 1.48V進行統計，所有數據采用軟件Graphad Prism 5.0進行處理，用SPSS 19.0（美國SPSS公司）進行單因素方差分析（One－way ANOVA），并進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌潤洗處理對煙草和擬南芥萌發指標的影響

2.1.1 萌發率變化

研究表明，滅菌后不潤洗對煙草種子萌發無顯著作用；而擬南芥種子萌發則受到顯著抑制；滅菌水潤洗兩種種子萌發率均較高，隨潤洗次數增加煙草萌發率呈增加趨勢，而擬南芥則呈降低趨勢；無水乙醇潤洗完全抑制無粘液質煙草種子的萌發，而粘液質擬南芥種子仍保持一定萌發率。無水乙醇對粘液質種子萌發的影響小于無粘液質種子。圖1

圖1 不同滅菌潤洗處理下煙草（A）和擬南芥（B）發芽勢變化Fig．1 Effects of different rinse treatments after sterilization on germination potential with N．tabacum（A）and A．thaliana（B）

通過水和無水乙醇不同潤洗處理的組合實驗，對日萌發情況統計結果顯示：煙草對照組（w＋5）從第2 d開始萌發，至第7 d基本穩定，萌發率達95.83%（圖2A）；而e＋1，w＋4處理的到第5 d初萌，第 7 d萌發率僅為5.83%；其余處理的萌發率幾乎為0（圖2A；圖3）。由此顯示，無水乙醇潤洗極顯著地抑制煙草種子萌發（P＜0.001）。擬南芥在w＋5或e＋5處理的種子萌發情況類似均低且慢，到第7 d時萌發率為 38.33%或50.83%（圖2B）；而其他處理的萌發趨勢一致，到第7 d時萌發率均超過94.0%（圖2B；圖4）。由此可見，無水乙醇和滅菌水結合潤洗方法能極顯著提高擬南芥的萌發率。圖2，圖3，圖4

圖2 不同滅菌潤洗處理下煙草（A）和擬南芥（B）日萌發變化Fig．2 Effects of different combination of rinse treatments after sterilization on everyday germination with N．tabacum（A）and A．thaliana（B）

圖3 不同滅菌潤洗處理7 d后煙草萌發Fig．3 The effect of different rinse treatment after sterilization for 7 days on N．tabacum germination

圖4 不同滅菌潤洗處理7 d后擬南芥萌發Fig．4 Effect of different rinse treatment after sterilization for 7 days on A．thaliana germination

2.1.2 發芽指數和活力指數的變化

研究表明，煙草處理組（以 w＋5為對照）的種子發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數與對照組相比均有極顯著差異（P＜0.001），顯示無水乙醇強烈抑制煙草萌發并降低種子活力。擬南芥種子在e＋5處理下的發芽勢、發芽指數和活力指數與對照相比無顯著差異，而其他四種處理與對照差異極顯著。擬南芥處理組種子發芽率除了 e＋5，其余與對照組相比均有顯著差異（P＜0.01）。先e＋2后 w＋3的種子活力指數最高。說明無水乙醇短時間處理能夠促進擬南芥種子萌發。表1

表1 不同滅菌潤洗處理下煙草（A）和擬南芥（B）發芽勢、發芽率、發芽指數及活力指數變化Table 1 Effects of different rinse treatment after sterilization on germination（G）potential，G percentage，G index and vigor index with N．tabacum（A）and A．thaliana（B）

2.2 不同滅菌潤洗處理對煙草和擬南芥幼苗的影響

2.2.1 幼苗根長的變化

對煙草和擬南芥幼苗的主根長測量（以w＋5作為對照）結果顯示，煙草處理組的主根長極顯著低于對照組（P＜0.001），顯示無水乙醇抑制煙草幼苗根的伸長（圖5A）；擬南芥處理組的主根長與對照無顯著差異，但隨著無水乙醇潤洗時間延長，擬南芥主根長有增加趨勢（圖5B）。圖5

2.2.2 幼苗株高和葉片數變化

對煙草和擬南芥幼苗的株高和葉片數測量（以w＋5為對照），結果顯示：煙草處理組除（先e＋1后 w＋4）的株高和葉片數顯著低于對照組外，其他乙醇處理組種子均未萌發；擬南芥除 e＋5外，其他處理的株高和葉片數均顯著高于或不低于對照，先e＋1后w＋4處理的株高最高，而先e＋2后w＋3處理的葉片數最多。以上結果顯示無水乙醇顯著抑制煙草種子萌發及幼苗生長；而無水乙醇短時間處理能夠促進擬南芥幼苗增高及葉片數增多。圖6

圖5 不同滅菌潤洗處理下煙草（A）和擬南芥（B）主根長變化Fig．5 Effects of different rinse treatment after sterilization on main root length with N．tabacum（A）and A．thaliana（B）

圖6 不同滅菌潤洗處理下煙草和擬南芥株高及葉片數變化Fig．6 Effects of different rinse treatment after sterilization on plant height and leaf number with N．tabacum and A．thaliana

表2 不同滅菌潤洗處理下煙草（A）和擬南芥（B）萌發率、活力指數及幼苗生長變化Table 2 Effects of different sterilization on germination（G）percentage，vigor index and seedling growth with N．tabacum（A）and A．thaliana（B）

對煙草和擬南芥的萌發率、活力指數、主根長和葉片數比較結果顯示，無水乙醇強烈抑制煙草的萌發、主根伸長、降低種子活力、抑制幼苗株高增加及葉片數增多；無水乙醇短時間處理能夠促進擬南芥萌發、主根伸長、增強種子活力、促進幼苗株高增加及葉片數增多。但無水乙醇長時間處理則對擬南芥幼苗的萌發、幼苗生長產生明顯抑制作用（P＜0.01）。表2

3 討 論

植物遺傳轉化中無菌苗的準備是轉基因成功的前提條件［2－4］。種子在無菌條件下萌發并成為健壯的無菌苗受多種因素影響，如種皮的限制、消毒劑類型、滅菌時間等均能導致種子萌發率降低或不能萌發［6，22］，因此選擇高效快速的滅菌方法對后續實驗具有良好的促進作用。通常種子在滅菌處理后的潤洗多采用滅菌水，但對于不同類型的種子如粘液質種子則通常采用乙醇潤洗［1，19］。為了深入探索兩種潤洗方式的區別并為后續實驗提供參考，研究中比較了具粘液質擬南芥種子和無粘液質煙草種子的潤洗方法。結果顯示，用無水乙醇和滅菌水交替潤洗與無水乙醇或滅菌水單獨潤洗相比能夠顯著促進擬南芥種子的萌發，萌發率均達到90%以上；而乙醇的添加對無粘液質的煙草種子萌發具有強烈的抑制作用（終萌發率小于30%）。前人研究顯示，粘液質對種子萌發及抵御不良環境具有重要生態學意義，當環境水分充足時，粘液層形成一個天然屏障阻隔有害物質入侵［23］。然而種子粘液層的形成在一定程度上也阻礙了胚根生長［23，24］。而乙醇潤洗能夠吸走水分使粘液層變薄從而減弱對胚根突破種皮的束縛作用，因此研究中擬南芥種子的胚根長度隨無水乙醇潤洗次數的增加而呈增加趨勢（圖5B）。而對煙草無粘液質種子而言，無水乙醇潤洗帶走了種子中的部分水分，從而使種子萌發受到強烈抑制。同為小種子，有無粘液質對滅菌方法的選擇具有重要意義。

不同潤洗方法還能導致后期幼苗生長狀況的差異，從而使遺傳轉化效率及隨后的轉基因植物表型鑒定造成誤差［25］。研究不同潤洗方法結果顯示，無水乙醇潤洗顯著抑制煙草幼苗生長；擬南芥幼苗的側根數隨無水乙醇與水交替組合不同而產生顯著差異，且與主根長的結果相反。此外，擬南芥幼苗株高和葉片數隨無水乙醇潤洗次數增加呈先升高后降低的趨勢，該結果與胡遠等［26］結果相似，說明用無水乙醇短時間潤洗抑制煙草但能促進擬南芥株高和葉片數的增加。

種子萌發和幼苗生長是一個復雜的生理過程，實驗對具粘液質和無粘液質種子無菌培養滅菌后潤洗方法進行了初步探索，獲得的結果將為植物遺傳轉化及轉基因株系的表型檢測提供理論依據。

4 結 論

4.1 采用不同潤洗方法對煙草和擬南芥種子進行處理，結果表明，無水乙醇對煙草種子的萌發具有強烈的抑制作用；無水乙醇短時間處理能夠促進擬南芥種子的萌發。

4.2 無水乙醇對煙草幼苗的主根、株高和葉片數均有強烈抑制作用；無水乙醇短時間處理能夠極顯著促進擬南芥幼苗的株高增加和葉片數增多，而長時間處理則產生抑制效應。

4.3 研究采用無水乙醇 ＋10%NaClO＋滅菌水潤洗5次的組合方法對煙草種子滅菌效果最好；無水乙醇 ＋10%NaClO＋［無水乙醇洗2次＋滅菌水洗3次］的組合對擬南芥種子滅菌效果最好。

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Effects of Different Rinse Treatments after Seed Sterilization on Germination and Seedling Growth in Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana

ZHANG Jing－hua1，MA Ya－li2，3，LAN Hai－yan1
（1．Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China；2．College of Resource and Environment，Xinjiang University，Urumqi 830046，China；3．Xinjiang Education Institute，Urumqi 830043，China）

【Objective】To obtain abundant and healthy sterile seedlings efficiently is the basis for next step experiment in plant genetic transformation and methods of sterilization of seeds are of great significance to the seed germination and subsequent seedling growth and the oncoming experimental study.【Method】Effects of different post－treatment of seed sterilization on germination and seedling growth of Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana were compared by rinsing seeds alternatively with sterilized water and absolute ethanol after NaClO sterilization，which was expected to reveal the best way of seed sterilization for N．tabacum seed without mucilage and A．thaliana seed with mucilage.【Result】Results showed that rinse of seeds with absolute ethanol had significantly negative effect on seed germination and seedling growth of N．tabacum and the germination percentage，root length and plant height were significantly decreased；whereas rinse of seeds of A．thaliana with absolute ethanol for a short time could promote seed germination，seedling growth，however，long time treatment with absolute ethanol exerted negative effect except for the main root elongation.Among various treatments，rinse of seeds with sterilized water and after 10%sodium hypochlorite for 4 minutes was the best to N．tabacum seeds；rinse of seeds with absolute ethanol for 2 times plus sterilized water for 3 times after 10%sodium hypochlorite for 4 minutes was the best to A．thaliana.【Conclusion】Although both seeds of N．tabacum and A．thaliana are small，there is significant difference between the two in post－treatment of sterilization method，which is meaningful for plant genetic transformation and phenotype analysis of the transgenic lines.

Nicotiana tabacum；Arabidopsis thaliana；sterilization；seed germination；seedling growth

S47

A

1001－4330（2016）09－1683－09

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.016

2016－04－22

國家自然科學基金項目（31460043）；自治區優秀青年科技人才培養項目（2013721013）

張晶華（1991－），女，河南人，碩士研究生，研究方向為植物抗逆分子生物學，（E－mail）zhangjinghua187＠126.com

（Cotresponding author）：蘭海燕（1969－），女，新疆人，教授，博士，博士生導師，研究方向為植物抗逆分子生物學，（E－mail）lanhaiyan＠xju.edu.cn

Fund project：NSFC（31460043）and outstanding youth science and technology personnel training project of Xinjiang Uygur Autonomous Region（2013721013）.